刘振华 丁 杰

(贵州省人民医院胃肠外科，贵州 贵阳 550002)

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，在我国肿瘤中仅次于肺癌、胃癌、肝癌，名列第四位〔1,2〕；其致死率高，我国每年约有20万人死于结肠癌〔2〕。目前，消化道肿瘤的诊断主要以内镜检查联合病理诊断为主。因其侵入性，且受内镜医师判断能力、患者配合程度等多因素影响，因此寻找确切的肿瘤标志物以提高结肠癌早期诊断率具有重要的临床意义。近年来研究发现，环状(circ)RNAs是信使(m)RNA剪接过程中的产物，大量分布于原核和真核细胞生物中，因其分布广泛、结构稳定保守、形式多样的特性而丰富了RNA家族的内容，使其成为非编码(nc)RNA研究领域的新星〔3〕。研究发现〔4〕，其生物学功能参与正常生理及疾病、甚至肿瘤的发生发展。这种新型的ncRNA可以由细胞分泌的外泌体进入细胞外环境，并可以通过非侵入性的方法识别和检测，如大便、血液和其他体液样本，为circRNAs可能成为潜在有效的结肠癌早期筛查分子靶标提供了极大的便利，对提高结直肠癌早期诊断率及预测其预后具有重要意义。因此本文就circRNAs在结直肠癌研究中的现状做一综述。

1 circRNAs概述

1.1circRNAs生成 自从单链circRNAs结构在上世纪70年代研究类病毒的过程中首次被发现以来，随着生物技术，尤其是转录组测序技术及其分析技术的发展，越来越多的circRNAs得以发现〔5～7〕。但circRNAs的产生机制、调控过程尚未完全清楚，可能受顺式调控元件与反式作用因子调控，主要包括内含子环化和外显子环化两种途径，通过“内含子配对驱动环化”〔8〕或“外显子跳读”〔9〕机制形成，其序列中不仅包含1～2个内含子或1～5个外显子，也含有基因间区或非编码区域〔10〕。根据circRNAs的序列构成主要可分为三类，外显子来源、 内含子来源及由外显子-内含子共同构成的circRNAs。目前认为，外显子来源的circRNAs是在mRNAs前体剪切过程中，外显子的 5′端与3′端以反向剪切形式形成 3′，5′磷酸二酯键，共价闭合形成的，大部分具有microRNA(miRNAs)结合靶点〔11〕。在人类细胞中存在核内circRNAs：环状内含子RNA(ciRNAs)，其形成可能由于脱支失败而积累；进一步发现ciRNAs在核中丰富但不富集miRNAs靶点。敲除ciRNA会导致其亲本基因的表达下降；某些ciRNAs能充当PoⅢ转录的正调控因子，对其亲本编码基因发挥顺式调控作用〔12〕。外显子-内含子circRNAs(EIciRNAs)作为环状RNA的亚型，被认为是基因组编码的调控元件，而不是不可避免的基因表达噪声〔12〕。

1.2circRNAs生物学特征 在大量的非蛋白质编码RNAs家族中，circRNAs是一类新型的小分子RNA，可以作为一类新的长链非编码RNA(lncRNAs)。现在已知这种新型的RNA在所有组织中表达，一般表达水平较低，但在真核转录组中高度表达。据报道，在不同的动物物种中，circRNAs普遍存在，可能是调控发育的基因表达程序组分〔13〕。此外，他们随后报道了circRNAs的相对丰度以基因和细胞类型特异性方式调节，其表达水平与典型线性mRNAs的水平相当，并且某些circRNAs可抵抗核糖核酸外切酶的消化作用〔13〕。

在人类细胞中存在多达25 000个不同的circRNAs，虽然大多数circRNAs在正常组织表达水平较低，但是有些已经被证明比它们的线性RNA表达更丰富〔10，13〕。circRNAs的独特性质是它们与其他lncRNAs的结构不同。真核细胞中大多数circRNAs虽缺少3′poly(A)尾和5′端帽，但均能较稳定地分布于细胞质中。 Jeck等〔10〕用荧光原位杂交技术(FISH)方法对放线菌素D处理过的Hs68细胞验证了HIPK3，circ HIPK3优先位于细胞质中，这与先前的circRNAs研究一致。 Guo等〔14〕检测了circRNAs的亚细胞定位，重点研究了在K562全细胞样品中检测到514个circRNAs，发现这些circRNAs主要存在于多聚A尾消耗的细胞质样品中。显然，有效转运至细胞质的内源性circRNAs可能经历核输出或在有丝分裂过程中释放至细胞质中。研究〔13〕发现跨越<5个外显子的大多数circRNAs具有核糖核酸外切酶抗性。且所有预测为circRNAs对核糖核酸外切酶具有抗性，而所有预测的线性序列对核糖核酸外切酶高度敏感。

1.3circRNAs功能 circRNAs在多种类型的癌症中呈现出异常表达，包括结直肠癌，肝细胞癌和胰腺导管腺癌；基于circRNAs在癌症中的功能，circRNAs可作为肿瘤诊断的潜在生物标志物并为癌症治疗提供新的治疗靶点〔15〕。目前对于circRNAs的生物学功能仍未完全清楚，一些可能的功能与自身的环形结构相关，发挥分子“海绵”作用是circRNAs目前相对较明确的重要功能，通过吸附miRNAs形成circRNA-miRNA-mRNA调控网络影响基因表达〔4，16〕。在人类HeLa细胞和胚胎干细胞hESCs-H9的研究中发现外显子-内含子circRNAs与聚合酶Ⅱ的延长机制有关，其作用机制为circRNAs充当聚合酶Ⅱ在转录时的正向调节因子，发挥顺式调节作用调节亲本编码基因转录〔17,18〕。 circRNAs功能不仅能作为miRNA海绵，而且在某种情况下可以作为反式作用调节因子与多种疾病包括结肠癌在内密切相关。据推测，circRNAs形成一类转录后调节因子，作为miRNA海绵与内源性RNA网络竞争，直接影响相关基因的表达〔19〕。 circRNAs可以隔离特定的miRNA复合物并在切割后释放它们〔4〕。ciRS-7作为“海绵”吸附miR-7相互作用形成miR-7抑制剂或海绵复合物可能影响细胞的发生〔19〕。类似地，睾丸特异性circRNA(Sry)调节miR-138的活性〔4〕。因此，ciRS-7和Sry分别与miR-7和miR-138复合，形成microRNA海绵发挥阻断或抑制功能，减少相应癌症的侵袭、转移和增殖〔20〕。一项食管鳞状细胞癌的研究发现circ-Foxo3(hsa_circRNA_104170)可结合8种miRNA(miR-22、miR-136、miR-138、miR-149、miR-433、miR-762、miR-3614-5p 和 miR-3622b-5p)及Foxo3蛋白和Foxo3 mRNA。 circ-Foxo3对这些miRNA具有强化作用，促进Foxo3 mRNA翻译，抑制肿瘤生长和癌细胞增殖〔21〕。随着研究的深入，发现上万种circRNAs具有这种海绵吸附作用，然而目前得到功能验证的仅是少数部分〔22〕，近来发现circRNAs作为肿瘤抗原在调节肿瘤免疫和免疫治疗中发挥潜在作用〔23〕。因此关于circRNAs更多的功能有待进一步探索。

2 circRNAs与结直肠癌

2.1circRNAs在结直肠癌中的表达特征 近年来，对circRNAs在肿瘤恶性生物学行为中发挥的作用及机制的深入探索表明circRNAs参与了结直肠癌的发生、演变过程。研究发现〔24〕，在结直肠癌细胞系和组织中，与正常细胞及组织相比，整个circRNAs表达谱丰度降低，推测可能促进了结直肠癌细胞的增殖。Bachmayr-Heyda等〔25〕报道结直肠癌细胞系和肿瘤样本中的circRNAs丰度与结直肠癌患者的正常黏膜相比整体减少。与正常结肠黏膜样本(78.1%)相比，肿瘤样本中circRNAs的表达(27.8%)降低。在11个结直肠癌细胞系中也得到了证明，其表达率甚至更低〔25〕。为了验证与正常黏膜样品相比结直肠癌中减少的circRNAs表达，通过核糖核酸酶消化和随后的深度测序富集circRNA分析，报道了21 653个不同的circRNAs。最近发现，hsa_circ_0007534在一组33例结直肠癌患者的配对样本中，与癌旁组织相比显著上调，且其表达与肿瘤分期和淋巴结转移有关；此外，siRNA沉默hsa_circ_0007534显著抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡〔26〕。这表明circRNAs普遍存在于结直肠癌组织中并与正常或癌旁组织表达有显著差异，被认为是具有潜在诊断和治疗意义的理想候选生物标志物。

2.2circRNAs与结直肠癌肿瘤学行为的关系 研究表明，circRNAs与肿瘤的恶性程度、分期及淋巴结转移相关。Hou等〔27〕报道了6例肿瘤组织和癌旁正常黏膜配对样本中，发现hsa_circ_001988在肿瘤组织中显著下调，且肿瘤的分化程度及神经周围浸润程度与其表达水平具有相关性。然而，Xie等〔28〕发现结直肠癌组织中circ_001569的表达水平显著高于结直肠癌旁组织，并与结直肠癌的侵袭性特征相关，包括远处转移和分化不良，并发现miR-145的水平在结直肠癌组织中显著降低。同时在四个结直肠癌细胞系(过表达SW480和HCT116中，并在SW620和LOVO中沉默)中过表达和沉默circ_001569，发现circ-001569过表达细胞的增殖和侵袭能力增强，而沉默的细胞增殖侵袭能力明显减弱。此外，使用生物信息学方法及荧光素酶标记、RT-qPCR和Western印迹分析发现circ_001569增加了SW480和HCT116细胞中E2F5、BAG4和FMNL2的蛋白质水平，SW620和LOVO细胞中的circRNAs有相反作用。Zhu等〔29〕通过circRNA芯片检测发现circ-BANP在35个结直肠癌组织中过表达，通过敲除或干扰circ-BANP可有效抑制结直肠癌细胞增殖。在结肠息肉与结肠癌样本研究中，发现circCCD66控制多种病理过程，包括细胞增殖、迁移和侵袭，动物模型中敲低circCCD6可有效抑制肿瘤生长和侵袭〔30〕。另一项研究发现〔31〕，has_circ_0020397可抑制miR-138发挥作用，促进结直肠癌细胞的活性、侵袭并抑制其凋亡，而miR-138具有相反作用。进一步研究发现has_circ_0020397抑制结直肠癌细胞活力、侵袭和促进凋亡可通过促进miR-138靶基因表达来实现〔31〕。肺是结直肠癌腹外转移最常见部位，研究发现〔32〕circRNAs在肺转移患者的结直肠癌组织与无转移的结直肠癌组织相比，表达有差异。进一步分析发现，上调的circRNAs基因参与DNA修复，而产生下调的circRNAs基因富含信号转导。其中下调的circRNA基因参与了核因子-κB和Wnt信号通路。此外，证明hsa_circRNA_105055、hsa_circRNA_086376和hsa_circRNA_102761能够与调节miR-7的靶基因PRKCB、EPHA3、BRCA1和ABCC1共同结合〔32〕。这为解释结直肠癌肺转移提供了新视角。

Zhuo等〔33〕研究6种细胞系与122个结直肠癌组织中发现circRNA0003906表达水平显著下调并与淋巴结转移和肿瘤分化差异显著相关。研究〔34〕通过实时聚合酶链式反应对170对配对结直肠癌样品进行测定、验证，发现hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700表达水平与患者临床病理学特征之间的关联。研究表明，结直肠癌中hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700的表达水平显著低于正常组织。与正常组织相比，结直肠癌组织中有125个下调的和76个上调的RNA。 hsa_circRNA_103809的表达水平与肿瘤淋巴结转移显著相关，而hsa_circRNA_104700的表达水平与远处转移显著相关。这些结果表明，hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700可能潜在地参与了结直肠癌的发展，并可作为结直肠癌诊断的潜在生物标志物。另一项研究发现〔35〕在结直肠癌组织中hsa_circ_0000069高表达，并且与患者的年龄、淋巴结转移和肿瘤分期相关。进行功能分析发现敲低hsa_circ_0000069能显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞周期的G0/G1期停滞。该研究首次证明了hsa_circ_0000069是结直肠癌进展中的一个重要调节因子，这可能成为结直肠癌诊断和治疗一个潜在靶点。Dou等〔36〕为了研究circRNAs在结直肠癌进展期的调节作用，使用了仅在鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)突变状态上不同的3种同基因结肠癌细胞系。与DKs-8细胞相比，他们发现DLD-1和DKO-1细胞中的circRNAs整体显著下调，表明突变KRAS对circRNAs的丰度产生了影响。这一发现在两个独立的结肠癌细胞系HCT116(KRAS突变体)和HKe3(KRAS WT)中也得到了证实。在三种细胞系中，circRNAs在分泌的胞外囊泡中也被检测到，并且circRNAs在外泌体中比在细胞中更丰富。这使得circRNAs作为结直肠癌潜在的肿瘤标志物通过液体检测提供了依据。

2.3circRNAs在结直肠癌放化疗抗性中的作用 术前5-氟尿嘧啶(5-FU)放化疗是局部晚期结直肠癌的标准治疗方法。然而，产生放化疗抗性是临床面临的重要问题。Xiong等〔37〕通过circRNA芯片技术阐述了局部晚期结直肠癌放化疗抗性相关的circRNAs表达谱及调控机制。生物信息学分析发现5种circRNA调控多种癌症和癌症相关通路，探讨结直肠癌放化疗抗性可能的机制，并提出了克服结直肠癌放化疗抗性的潜在靶标。功能富集分析发现actin-cytoskeleton、focal adhesion及Wnt信号通路均受差异表达的circRNAs调节。既往的报道发现miRNAs在结肠癌对5-FU的耐药中发挥作用〔38〕。因此，circRNAs是否通过调节miRNAs参与结肠癌对化疗药物抵抗或增强敏感性方面有待深入研究。

综上，circRNAs对肿瘤发生和发展有深远的影响。circRNAs在肿瘤进展中的主要作用可能是通过控制miRNA靶标来调控癌基因和(或)抑制基因的表达，在肿瘤的发生和恶性行为中起着重要的作用。然而，关于结直肠癌中circRNAs和miRNAs之间正向或负向关系的分子机制仍知之甚少。circRNA与恶性肿瘤之间的关系及调控机制仍需要进一步探索。