封忠昕 陈 琦 闵 迅 龚玉萍 袁 钟 黄 锐 陈 迪 王 虹 冯 进

(遵义医学院附属医院医学检验科，贵州 遵义 563003)

急性髓系白血病(AML)是较常见的急性白血病，极易引起患者复发及死亡〔1〕。可溶性CD40配体(sCD40L)可通过阻滞多发性骨髓瘤细胞、B淋巴细胞/白血病(Bcl)-2于G0/G1期，从而明显诱导肿瘤细胞凋亡〔2〕。研究发现，经不同浓度sCD40L处理白血病HL-60细胞后，Bcl-2、生存素(survivin)及白细胞介素6表达下降，CD95表达上升，推测可能是通过死亡受体和线粒体信号等途径抑制白血病细胞增殖，诱导HL-60细胞凋亡〔3，4〕。本实验分析sCD40L对人白血病急性单核细胞白血病细胞(THP)-1细胞凋亡、周期的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 白血病THP-1细胞株购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心，胎牛血清和RPMI1640购自美国Gibco公司；sCD40L购自以色列ProSpec公司；RNA提取试剂盒和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒及引物均购自TaKaRa生物工程公司。细胞周期检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；Bcl-2、半胱天冬酶(caspase)-3一抗(小鼠抗人)购自美国Cell Signaling Technology，Inc(CST)公司；二抗(羊抗兔)购自美国Santa Cruz公司。

1.2方法 细胞THP-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中，取对数生长期细胞进行实验。分为空白组(对照组)：不加任何药物干预组;sCD40L实验组：sCD40L浓度2.0、4.0和6.0 μg /ml。

1.3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率 收集实验所需细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，每管加入500 μl结合缓冲液重悬细胞后加入5 μl Annexin V-FITC进行染色，混匀，加入PI 5 μl室温避光孵育15 min，1 h内上机检测。

1.4FCM检测细胞周期 收集实验所需细胞，PBS洗2次，-20℃预冷70%乙醇固定过夜。上机前用PBS洗2次，100 μl PBS重悬细胞加入2 μl RNA酶，37℃孵育15 min，再用PBS洗，100 μl PBS重悬细胞，加入PI 5 μl，室温避光孵育5 min，最后加入PBS至500 μl体积，混匀后上机检测。

1.5Bcl-2及caspase-3 mRNA测定 提取收集实验所需细胞的RNA。反应体系：试剂5×Prime ScriptTM缓冲液(用于实时荧光定量)使用量6.0 μl；Prime ScriptTMRT酶混合物Ⅰ 1.5 μl；Random 6 mers(100 μmol/L)1.5 μl;Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1.5 μl;总RNA 19.5 μl;总反应体积为30 μl。37℃ 15 min逆转录，85℃ 5 s灭活逆转录酶。逆转录产物cDNA放置-20℃冰箱保存。按说明进行实时荧光定量PCR，取1 μl逆转录产物cDNA进行PCR扩增。反应总体积为20 μl，内含SYBR®Premix Ex TaqTM10 μl，引物混合液(上游、下游引物)1 μl，1‰焦碳酸二乙酯(DEPC)水8 μl。 预变性 95℃ 30 s 1个循环，PCR反应 95℃ 5 s；60℃ 30 s，40个循环。β-actin上游引物：TGGCACCCAGCACAATGATGA，下游引物：ACTAAGTCATAGTCGCCTAGAAGCA；Bcl-2上游引物：CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC，下游引物：CCGCATGCTG-GGGCCGTACAGTTCC；caspase-3上游引物：GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA，下游引物：AGGTTTGCTGCATCGACATCTG。结果以2-△△Ct相对值来反映基因表达的改变。

1.6Bcl-2及caspase-3蛋白表达的测定 收集实验所需细胞，PBS洗2次，加入细胞裂解液裂解细胞，12 000 r/min离心15 min后取上清，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入一 抗，孵育4℃过夜，再与二抗室温孵育2 h，最后电化学发光(ECL)试剂盒显色后曝光检测分析，β-actin作为内参，分析各组蛋白表达情况。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1不同浓度sCD40L对HL-60细胞凋亡的影响 不同浓度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1细胞48 h后，细胞凋亡率由(34.26±2.05)%、(51.37±3.64)%上升到(65.82±4.76)%，与对照组(22.54±1.63)%比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2不同浓度sCD40L对THP-1细胞周期的影响 不同浓度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1细胞48 h后，白血病细胞停滞于G0/G1期，随着sCD40L浓度增加，THP-1细胞处于G0/G1期的比例从(73.45±6.08)%、(76.32±7.14)%上升到(85.27±6.96)，与对照组(60.33±5.21)%比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3Bcl-2、caspase-3 mRNA及蛋白水平的变化 不同浓度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1细胞48 h后，Bcl-2 mRNA表达从(47.96±4.03)、(31.78±2.65)下降到(15.09±1.12)，与对照组(62.17±4.98)比较差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2蛋白表达从(2.38±0.21)、(1.62±0.13)下降到(0.97±0.05)，与对照组(2.96±0.18)比较差异有统计学意义(P<0.05)；caspase-3 mRNA表达从(20.17±1.77)、(42.36±3.02)上升到(51.16±4.39)，与对照组(5.21±0.48)比较差异有统计学意义(P<0.05)；caspase-3蛋白表达从(1.25±0.11)、(1.83±0.15)上升到(2.34±0.17)，与对照组(0.49±0.02)比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

AML是起源于造血干细胞的恶性血液肿瘤，病情常发展迅速，靶向治疗是目前认为较为可取的发展方向〔5〕。在实体瘤尤其是肺癌研究中，sCD40L抗肿瘤作用得到研究者较一致认同〔6〕。另外在血液系统恶性肿瘤中，sCD40L可显著抑制多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病的体外增殖，导致肿瘤细胞呈现G1期阻滞，从而诱导骨髓瘤细胞及白血病细胞凋亡〔2〕。本实验进一步印证了sCD40L具有抗白血病作用。

Bcl-2是较常见的抗凋亡因子之一，在细胞线粒体凋亡途径中发挥极为重要的作用，可用于检测肿瘤细胞凋亡程度和药物疗效的评价〔7〕。在乳腺癌、肾透明细胞癌等Bcl-2高表达与肿瘤发生及发展相关〔8,9〕。在急性白血病方面，有研究表明Bcl-2的表达在完全缓解组和正常对照组低于初治和难治复发组〔10〕。本实验结果说明sCD40L抗白血病作用与Bcl-2密切相关。国外已研究应用Bcl-2抑制剂治疗AML〔11〕。

caspase-3在各种肿瘤中表达不一，如在食管癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中低表达，而在卵巢浆液性癌中高表达，可能由于肿瘤种类不同等原因导致〔12～14〕。有实验发现，予雷帕霉素等处理白血病K562细胞后，可通过激活caspase-3从而促进细胞凋亡〔15〕，本实验结果说明sCD40L抗白血病作用与caspase-3有关，与Liu等〔16〕予苦参碱干预白血病THP-1细胞后，通过激活caspase-3诱导凋亡，阻滞白血病细胞于G0/G1期一致。

综上，在一定浓度范围内，sCD40L 在体外能够阻滞白血病THP-1细胞在G0/G1期，其可能机制是通过下调Bcl-2及激活caspase-3，线粒体凋亡途径发挥重要作用。