李伟伟 李归冀 樊 华 李剑平

(沈阳中心血站(辽宁省血液中心)，沈阳 110044)

外泌体越来越多地被认为是疾病的生物标志物和预后因子而进行广泛研究。外泌体应用在血液系统恶性肿瘤的诊疗研究方面进展迅速，研究热点主要集中在：外泌体在肿瘤发生发展中的作用机制，外泌体miRNA与肿瘤发生发展的相关性，外泌体介导的肿瘤细胞的免疫逃逸，外泌体作为肿瘤诊断的生物标志物和外泌体相关的肿瘤化疗耐药等几大方面。本文将就血液系统恶性肿瘤外泌体的最新研究进展进行综述。

1 外泌体概述

外泌体(Exosomes)，也被称为细胞外囊泡(small extracellular vesicle,sEV)是一种在生理和病理情况下由细胞分泌的直径30～120 nm，富含蛋白质、脂质和RNAs等分子，具有脂质双层膜结构微小膜泡[1-3]。是在真核细胞内的多泡小体中形成分泌囊泡的一种亚型[4]，当这些多泡小体与质膜融合时分泌到细胞外。虽然囊泡亚型的研究越来越细化，但由于检测手段的限制，研究者们仍多将上述直径范围内的各亚型分泌囊泡统称为外泌体[5]。

外泌体具有靶向输送的能力，且其脂质双层膜结构是内包被物的天然保护屏障。生理情况下可通过受体介导的交互作用直接刺激靶细胞[6]，或通过向靶细胞转移各种生物活性分子，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，发挥其生物学功能[7，8]。随着近几年外泌体研究的不断深入，发现在肿瘤疾病状态下，机体细胞分泌的外泌体其组分、数量和功能与生理条件下相比都会发生改变：肿瘤细胞分泌的外泌体可包含肿瘤特异性蛋白和RNAs分子等，大部分肿瘤细胞分泌数量更多的外泌体颗粒，肿瘤细胞外泌体参与肿瘤细胞间信息传递与免疫调节，肿瘤外泌体可作为肿瘤疾病诊断的生物标志物。

在血液系统恶性肿瘤中，肿瘤细胞分泌的外泌体(Tumor-derived exosomes,TEX)重新编程肿瘤微环境，抑制机体抗白血病免疫，介导肿瘤耐药并干扰机体免疫治疗和参与血液肿瘤恶性转化，因此TEX被视为抗血液系统恶性肿瘤的有希望的生物标志物和潜在治疗靶点。

2 外泌体的分离提取与鉴定

2.1外泌体的分离提取 外泌体的纯度是外泌体相关研究中最重要的问题。外泌体研究的关键步骤是如何从不同样本中获取一定浓度的高纯度的外泌体样本。外泌体的富集主要有传统的高通量方法和较新的微流控、非接触和免疫吸附法等。传统的高通量方法主要包括：超速离心法、沉淀法、分子排阻法和场流分级法等，目前较多采用的提取方法有高速离心法、沉淀试剂盒法等。梯度密度离心法是公认的获取高纯度外泌体的方法，但是操作相对复杂[9，10]；沉淀试剂盒法实验操作相对简单但外泌体纯度一般，其沉淀物中多有铁蛋白、病毒颗粒等存在，电镜检测时较难观察到典型的茶托样具有清晰膜结构的纳米粒子外泌体图像[11，12]。

2.2外泌体的鉴定 外泌体的鉴定是外泌体分离获取后的重点和难点问题，只有经过多种方法鉴定均满足外泌体标准的沉淀获取物才可以被称为外泌体而进行下游实验。精准和绝对的外泌体尺寸规范还没有明确定义。2006年，外泌体领域专家第一次发表了胶体金电镜显示的典型外泌体形态结构图[13]，至今仍然为外泌体研究者们提供了经典的研究方法和图像参考。

目前为止，外泌体纯度、活性和提取鉴定标准仍以实验室标准为主。外泌体鉴定的常规方法包括：透射电镜进行外泌体结构观察、沉淀物粒子直径测量和Western blot检测外泌体蛋白，当透射电镜无法观察到外泌体典型形态时，需加做免疫胶体金电镜实验进行进一步观察。透射电镜可以观察到外泌体为茶托样具有清晰的膜结构；粒子直径分析系统测量颗粒物直径在30～120 nm之间(多数小于100 nm)；Western blot检测CD81、CD63和Hsp70等多种外泌体标志蛋白均阳性表达；免疫胶体金电镜观察到免疫胶体金颗粒较牢固的吸附于外泌体膜结构表面。目前研究者们已经建立了专门针对细胞培养上清、新鲜血浆和冻存血浆外泌体提取方案[14]，可重复、大规模和高通量的临床级外泌体生产纯化方案[15]，并采用电镜、纳米粒径分析和蛋白印迹等方法对沉淀物进行检测，均取得了较好的实验效果。

3 外泌体与血液系统恶性肿瘤

3.1白血病 白血病是血液系统高发的恶性肿瘤疾病，早期发现、早期诊断对指导患者临床用药、靶向治疗和判断疾病预后都具有重要临床意义。

3.1.1急性骨髓性白血病 急性骨髓性白血病是(Acute myeloid leukemia，AML)是一种造血干细胞或祖细胞分化受阻并无序增殖的恶性血液系统疾病，若不采取有效治疗则会迅速进入骨髓衰竭期[16]。然而人类对此病的微环境调控机制仍知之甚少。最新研究证实AML通过分泌外泌体将骨髓微环境重建成有利于白血病细胞生长和抑制正常造血功能的微环境[17]，AML衍生的外泌体通过抑制正常造血因子DKK1的表达和诱导骨髓基质细胞中的造血干细胞促进因子(CXCL 12、KITL和IGF1等)广泛下调，而营造有利于白血病细胞增殖和存活的微环境[18]。AML外泌体还可以促进健康造血干细胞生存并诱导白血病样功能特征，使miR21和miR29等过表达[19]。外泌体不但在肿瘤微环境构建中发挥重要作用，还介导干细胞与肿瘤细胞之间的信息传递，白血病干细胞源性外泌体可以促进AML细胞的增殖、迁移并抑制肿瘤细胞凋亡。

3.1.2急性淋巴细胞白血病 急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童白血病的主要类型且目前治愈成功率较高，但患儿仍然要承受多次重复骨髓活检所带来的巨大痛苦。原发性ALL和相应细胞系肿瘤细胞都会释放具有完整细胞器和组织细胞骨架的膜结构大囊泡，是介导细胞间通讯的重要结构介质[20]。研究人员还依据ALL外泌体包含肌动蛋白等囊泡分支结构，建立了一种对患者血液中的ALL外泌体进行追踪的实验技术，为急性粒细胞白血病的诊断、药物治疗和显著减轻患儿痛苦提供了启示[21]。该技术的建立为肿瘤外泌体是否可以提供肿瘤个性化信息及后续能否以此为依据开展个性化治疗提供了较好的科研思路和实验基础。

3.1.3慢性淋巴细胞白血病 慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)是成人常见的血液系统恶性肿瘤，外泌体相关研究主要集中在外泌体介导骨髓基质与CLL肿瘤细胞之间信息交换、生物标志物鉴定、免疫逃逸、恶性转化和化疗耐药等几大方面。

外泌体在慢性淋巴细胞白血病B细胞与骨髓微环境之间通讯具有关键作用[22，23]：通过对外泌体在CLL与微环境的相互作用关系进行深入研究发现，一方面CLL外泌体通过调节AKT信号转导通路，诱导VEGF等CLL促进因子高表达，进行肿瘤微环境调节；另一方面，微环境中骨髓基质细胞来源外泌体能够增强CLL B细胞的迁徙能力和化疗耐药性，并帮助CLL白血病细胞逃离自发或药物诱导凋亡。

CLL相关外泌体还参与肿瘤患者机体免疫调节。CLL小鼠单核细胞和巨噬细胞表面携带较多PD-L1受体，其衍生的外泌体RNA促进CLL患者单核细胞免疫抑制表型蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的表达，PD-L1免疫抑制点的调节为CLL患者供了一种新的免疫治疗预选方案[24]。研究者们对外泌体作为CLL物标志的研究较深入，CD19+、CD37+、CD52+外泌体和miRNA155+等均是CLL临床分期和指导用药的较好指标，含有CLL“白血病”转录物的外泌体还能够将其相关miRNA向健康间充质基质细胞传递，使其恶性增殖转化。

3.2淋巴瘤

3.2.1非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin′s lymphoma,HL)是血液系统肿瘤研究较深入的一种高发性淋巴瘤，1997年以CD20为靶点的非霍奇金淋巴瘤靶向药(也是人类历史上的首个癌症靶向药)——利妥昔单抗(Rituxima)在美国获批上市，从此癌症的靶向治疗进入了一个全新的快速发展阶段[25]。通过大样本临床试验发现，非霍奇金B细胞淋巴瘤患者血浆外泌体中含有C-MYC、BCL-XL、PTEN、AKT和BCL-6等多种mRNAs，是对肿瘤一线药物治疗无效的统计学显著性预测因子，可以对肿瘤进行检测和预后判断[26]：C-MYC mRNA与患者无进展生存期负相关；首次复发和疾病进展期患者外泌体BCL-XL和PTEN mRNA低表达；BCL-6 mRNA的表达含量与患者死亡率正相关，上述多种外泌体相关标志物的鉴定为非霍奇金淋巴瘤的诊断和治疗奠定了基础。而当肿瘤中外泌体CD20阳性表达时，外泌体可以截获Rituximab，使抗体与靶细胞的结合率降低，帮助肿瘤细胞免疫逃逸[27]。

3.2.2霍奇金淋巴瘤 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)是较高发的中老年血液系统肿瘤，埃博斯坦巴尔病毒(EBV)检测多为阳性表达[28,29]。研究证实EBV可以通过其外泌体途径使肿瘤中的巨噬细胞感染病毒并加速淋巴瘤的发展进程[30]。

3.3血液系统其他恶性肿瘤 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者循环外泌体miRNA对患者诊断和预后判断具有指导意义。MM患者血清中检测到外泌体存在，且通过实时定量PCR技术共分析了外泌体中22个miRNA，发现let-7b和miR-18a与患者无进展生存期和总生存期显著相关[31]。骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)患者外泌体可以通过传递miRNA、mRNA和蛋白质等介导骨髓基质与肿瘤细胞之间的信息交通[32]。与正常造血细胞相比较，IL-3受体在慢性粒细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia，CML)母细胞中过表达，可作为靶向给药的靶标。与传统直接给药组相比较，通过改造外泌体使其靶向CML-IL3R递送抗肿瘤药物-伊马替尼，外泌体给药组可明显抑制肿瘤细胞生长[33]。

4 结语与展望

研究表明外泌体在血液系统恶性肿瘤发生发展中发挥着重要作用，尤其是各种外泌体相关肿瘤生物标志物的成功鉴定为无创液体活检提供了广泛可能。如何生产出安全、靶向能力强、易于获取和高纯度的临床级别外泌体仍是外泌体研究领域的重点。虽然研究人员不断创新，建立了可以循环利用细胞培养液连续生产高浓度的细胞外泌体的中空纤维生物反应器和基于超顺磁纳米粒子簇快速获取高纯度外泌体的新方法[34]，但总体来讲，仍存在很大局限性和不确定性，有关外泌体活体回输后远期效应的研究仍较少涉猎，其免疫调节能力也仍需进一步广泛深入研究[35]。随着不断深入的研究，以外泌体为基础的诊疗体系必将会不断完善，将为广大血液病肿瘤患者诊断、治疗和预后开辟了新的临床诊疗视角。