刘文增 胡 渊 张 彩

(山东大学药学院免疫药物学研究所,济南 250012)

胰腺癌是世界上致死率最高的恶性肿瘤之一，其特点是发现晚、治疗难、 预后差，经手术切除及放、化疗等辅助治疗后的胰腺癌患者5年生存率仍低于10%[1]。胰腺癌的高致死率和极差的预后效果与胰腺癌肿瘤微环境密切相关，因此，也使得人们越来越重视对胰腺癌的基础研究，旨在进一步了解其生物学特性，并为发展新的辅助治疗手段提供依据。肿瘤免疫治疗主要是通过激活和增强人体的免疫系统达到消除肿瘤细胞的目的。近年来，免疫治疗在对黑色素瘤、肺癌等实体瘤的治疗中效果显著，已成为继手术及放、化疗之后又一重要的抗肿瘤手段。免疫治疗产生有效的抗肿瘤免疫应答需要细胞毒性CD8+T细胞、T辅助细胞、成熟的树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)等的协调作用。但是，由于肿瘤在发生发展的过程中进化出许多抑制免疫应答的机制，形成免疫抑制微环境，限制了肿瘤微环境中免疫细胞的活化和功能发挥，从而大大影响免疫治疗的效果。本文首先对胰腺癌肿瘤微环境特点进行介绍，然后对目前应用于胰腺癌的免疫治疗方法及临床试验结果进行总结，以期为针对胰腺癌肿瘤微环境特点设计新的免疫治疗策略提供思路。

1 胰腺癌的肿瘤微环境特点

肿瘤微环境是指肿瘤细胞与其周围的组织成分相互作用，从而形成一个复杂且有利于肿瘤细胞生物学行为的内环境。肿瘤微环境一般由三部分构成：(1)基质成分：包括细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)和基质细胞；(2)细胞成分：包括肿瘤细胞、内皮细胞及免疫细胞等；(3)可溶性因子：包括细胞因子及免疫调节分子等[2]。而胰腺癌的肿瘤微环境又有其自身特点：(1)大量紧密的基质成分，如活化增殖的胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cells，PSC)、肿瘤相关的成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAF)、Ⅰ型胶原蛋白沉积物、透明质酸及其他细胞外基质；(2)多种类型的固有免疫和适应性免疫的免疫细胞；(3)大量可溶性的免疫抑制因子等[3]。

1.1胰腺癌肿瘤外基质成分 胰腺癌最突出的特点之一是存在大量紧密的基质成分，包括活化的胰腺星状细胞、肿瘤相关成纤维细胞及细胞外基质等。(1)活化的胰腺星状细胞：在正常的胰腺组织中仅有极少量PSCs存在，多处于静息状态，主要分布在腺体周围。当胰腺细胞出现癌变后可分泌血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)及血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ)等多种细胞因子[4]，这些细胞因子与PSCs表面受体结合后活化下游信号通路，如胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)、p38 丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、信号转导和转录活化因子双激酶(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等[5-8]，促进PSCs活化、增殖。活化后的PSCs又能以旁分泌形式分泌多种生长因子，激活表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和PI3K-AKT-mTOR-S6K信号通路，促进胰腺癌细胞的生长、增殖，抑制其凋亡并增强其侵袭能力[9]。(2)肿瘤相关成纤维细胞：CAFs同样是胰腺癌肿瘤微环境中重要组成部分，其主要功能是分泌细胞外基质蛋白及参与肿瘤血管的生成。另外，CAFs还可通过分泌成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein-α，FAP-α)影响γ干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的活性，进而抑制杀伤效应T细胞的功能[10]；分泌炎症因子IL-6与肿瘤细胞表面的IL-6受体结合后活化STAT3信号通路促进肿瘤生长[11,12]；分泌趋化因子CXCL12阻碍CXCR4+T细胞向肿瘤内浸润[13]。(3)细胞外基质：在胰腺癌细胞周围存在大量细胞外基质，它们主要由胶原蛋白、Ⅰ、Ⅲ、Ⅺ型纤连蛋白、透明质酸等成分组成，沉淀堆积后形成致密的纤维组织，为胰腺癌细胞的生长创造了有利的肿瘤微环境[14]。一方面，堆积的细胞外基质导致瘤内血管坍塌闭塞，使抗肿瘤药物难以通过血液到达肿瘤内[15]；另一方面，肿瘤外纤维基质层如同一道物理屏障阻碍效应CD8+T细胞、NK细胞等效应细胞向肿瘤内浸润，使胰腺癌细胞逃避免疫监视[16]。

1.2免疫细胞 胰腺癌肿瘤微环境中存在多种类型的免疫细胞，但这些免疫细胞多处于数量与功能的失衡状态，通常表现为具有抗肿瘤作用的CD4+、CD8+效应性T细胞、NK细胞和DC细胞数量减少，并呈现无功能的或不成熟的表型和状态，而具有免疫抑制作用的调节性T细胞(CD4+regulatory T cells，Tregs)、髓源性抑制细胞(Myeloid derived suppressor cells，MDSC)及肿瘤相关的巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)功能活跃且大量存在。免疫抑制细胞、可溶性免疫抑制因子及效应细胞的“失能”状态，形成了胰腺癌的免疫抑制微环境，是胰腺癌对各种治疗方法不敏感，尤其是免疫治疗失败的重要原因。

1.2.1免疫抑制细胞

1.2.1.1Treg细胞 胰腺癌细胞通过分泌趋化因子CCL22与Treg细胞表面的CCR4受体结合，趋化Treg细胞向肿瘤部位聚集[17]。募集到肿瘤微环境中的Treg细胞通过分泌抑制性细胞因子，如TGF-β、IL-10等和细胞接触依赖性蛋白途径，如细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4途径(Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)和程序性死亡受体 1途径(Programmed death-1，PD-1)，抑制效应T细胞的活化和功能，介导了效应T细胞对胰腺癌肿瘤相关抗原免疫耐受，从而使肿瘤细胞逃避免疫监视。研究表明，肿瘤微环境中Treg细胞的数量与胰腺癌肿瘤进展及不良的预后效果成正相关[18,19]

1.2.1.2MDSCs 在胰腺癌肿瘤微环境中，PSCs可以通过活化STAT3信号通路促进髓系细胞向MDSCs分化[20]。此外，PSCs还可通过分泌IL-6、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)等诱导MDSCs向肿瘤部位聚集。MDSCs是胰腺癌免疫抑制微环境中的重要组成部分，可通过多种途径抑制效应T细胞功能：(1)“扣押”T细胞活化过程中必需的半胱氨酸；(2)表达高水平的精氨酸酶，分解T细胞蛋白合成所必需的精氨酸；(3)产生活性氧；(4)分泌免疫抑制因子TGF-β等[21]。

1.2.1.3TAMs 胰腺癌肿瘤微环境中的免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10等可以刺激巨噬细胞向具有促肿瘤作用的M2型巨噬细胞分化，成为TAMs。TAMs既能产生免疫抑制因子抑制抗肿瘤免疫反应，又能促进肿瘤血管生成、基质重塑及肿瘤细胞转移。研究表明，胰腺癌患者体内TAMs数量增加，是预后差的一个重要指标。

1.2.2“失能”效应细胞 由于胰腺癌免疫抑制微环境的影响，效应T细胞功能受到很大程度的抑制，辅助型T细胞更趋向于向Th2型细胞分化并分泌Th2型细胞因子。随着胰腺癌恶性程度的增加，CD8+T细胞数量显著减少而Treg细胞的数量显著增加[22]。同样受胰腺癌免疫抑制微环境影响，胰腺癌患者体内NK细胞数量明显减少，并有研究表明NK细胞表面活化受体(如NKG2D等)表达水平与胰腺癌恶性程度呈负相关[23]。除效应T细胞与NK细胞外，成熟DC细胞在抗肿瘤免疫反应中也起着重要的作用。在胰腺癌肿瘤微环境中DC细胞多呈不成熟表型且生存能力弱，无法将肿瘤抗原递呈给效应T细胞，启动抗肿瘤免疫应答。胰腺癌免疫抑制微环境导致免疫效应细胞处于“失能”状态，促进了胰腺癌肿瘤的发展与转移。

1.3可溶性的免疫抑制因子 在胰腺癌肿瘤微环境中存在着大量可溶性免疫抑制因子，是肿瘤细胞逃避免疫监视重要的机制之一。(1)TGF-β：TGF-β主要由Treg细胞、MDSCs及 TAMs产生，其主要作用是抑制效应T细胞的活化、增殖，诱导CD4+T细胞向Th2型细胞分化。此外，TGF-β还能促进成纤维细胞的生长和肿瘤外基质的形成，诱导肿瘤细胞分泌VEGF和基质金属蛋白酶2促进肿瘤的恶化及转移。(2)IL-10：IL-10 主要由Treg细胞、TAMs产生，其主要作用是抑制抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)的抗原递呈作用和效应T细胞的功能。(3)吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)：IDO的主要由MDSCs及胰腺癌细胞产生，其作用为催化效应T细胞活化过程中所必需的色氨酸分解成犬尿氨酸，从而抑制效应T细胞的活化[24]。除以上免疫抑制因子外，由活化的成纤维细胞分泌的IL-1、 IL-13及IL-23可促进CD4+T细胞向Th2或Th17辅助型T细胞转化，CCL5、CCL2和CCL17可招募单核细胞和Tregs细胞向肿瘤部位聚集[25]。

总之，胰腺癌细胞通过分泌多种细胞因子(如IL-10、TGF-β及IL-23)和趋化因子(如CXCL1-3、CXCL5、CXCL12、CCL2及VEGF-A)，促进周围基质细胞的活化和免疫抑制细胞(如Tregs、MDSCs及TAMs)向肿瘤部位聚集。活化的基质细胞产生大量细胞外基质在胰腺癌细胞周围形成纤维基质层，阻碍了效应T细胞及NK细胞向肿瘤内浸润。免疫抑制细胞Tregs、MDSCs及TAMs通过分泌免疫抑制因子，表达免疫抑制配体(如PD-L1、B7-1/2)抑制效应T细胞及NK细胞功能，导致免疫效应细胞处于数量与功能失衡状态，形成了胰腺癌独特的免疫抑制肿瘤微环境。

2 胰腺癌的免疫治疗方法

免疫治疗是指通过重新激发和增强肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应，从而消除肿瘤细胞的一种治疗手段。胰腺癌高表达多种肿瘤相关抗原，如黏蛋白1(Mucin 1，MUC-1)、癌胚抗原(Carcinoembryoni-cantigen，CEA)、前列腺干细胞抗原(Prostate stem cell antigen，PSCA)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、间皮素(Mesoth-elin，MSLN)及突变的K-ras等，成为胰腺癌免疫治疗的重要靶点。

2.1主动免疫治疗 主动免疫治疗是指通过接种疫苗使肿瘤相关抗原激发机体的肿瘤特异性免疫反应，达到消除肿瘤的目的。目前可用于主动免疫治疗的主要有GVAX疫苗、K-ras 疫苗、抗原肽负载的DC疫苗等。(1)GVAX疫苗：GVAX疫苗是指将含GM-CSF基因的腺病毒载体导入相应的肿瘤细胞，照射使其丧失分裂能力，成为仅保留分泌GM-CSF功能的肿瘤疫苗。在一项Ⅱ期临床试验中发现，胰腺癌患者术后以GVAX疫苗和5-FU进行联合辅助治疗，患者中位无病生存期为17.3个月，中位生存期为24.8个月。(2)K-ras疫苗：K-ras基因在胰腺癌中突变率很高，因而成为胰腺癌免疫治疗的一个重要靶点。有研究发现，阳离子纳米粒包裹的K-ras肽段疫苗对PANC-1人胰腺癌异种移植小鼠治疗效果明显，可明显延长小鼠的生存期[26]。(3)抗原肽负载的DC疫苗：肿瘤相关抗原MUC-1在90%的胰腺癌组织中过表达。在一项Ⅰ期临床试验中，7位胰腺癌患者接种MUC-1肽段负载的DC疫苗后，其中2名患者体内成熟DC细胞数量明显增加，外周血淋巴细胞被激活并产生大量IL-12p40和IFN-γ，但肿瘤并未出现明显的消退[27]。

2.2被动免疫治疗 被动免疫治疗是指具有免疫效应的物质在体外进行修饰后输入人体内，达到增强抗肿瘤免疫反应，消除肿瘤的目的。

2.2.1免疫检查点阻断治疗 胰腺癌肿瘤细胞通过过表达免疫抑制性配体，如B7-1、B7-2及PD-L1，与T细胞表面抑制性受体CTLA-4、PD-1结合后抑制效应T细胞活性，逃避免疫监视。免疫卡点阻断治疗是通过靶向阻断免疫调节分子逆转免疫抑制信号，进而增强抗肿瘤免疫反应的免疫治疗手段。

2011年，FDA批准上市了第一个靶向CTLA-4的人源化单抗Ipilimumab，用于晚期黑色素瘤患者的治疗。目前，Ipilimumab已广泛应用于黑色素瘤、肺癌、肾癌及前列腺癌等恶性肿瘤的治疗，其对胰腺癌的治疗效果也已进入临床试验阶段。有研究表明，Ipilimumab能促进T细胞的增殖和Th1型细胞因子的分泌，增强CD8+T细胞对Colo356/FG胰腺癌细胞的杀伤作用[28]。在一项针对胰腺癌的Ⅱ期临床试验中(NCT00112580)，单用Ipilimumab治疗的27位晚期胰腺癌患者中均未观察到客观的肿瘤反应，只有一位患者出现了迟发的抗肿瘤效应[29]。另一项临床试验(NCT00836407)结果显示，Ipilimumab与分泌GM-CSF的肿瘤疫苗联合治疗后促进了胰腺癌患者体内间皮素特异性的CD8+T细胞数量的增加，延长了患者生存期[30]。

目前，FDA批准上市了两种PD-1阻断抗体pembrolizumab和nivolumab，主要用于治疗转移性非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌以及头颈癌等。在小鼠胰腺癌肿瘤模型中，经抗PD-1或PD-L1阻断治疗后促进CD8+T细胞向肿瘤浸润和抗肿瘤免疫反应产生。在多项临床试验中，胰腺癌病人单用抗PD-1(NCT01313416)或抗PD-L1(NCT02009449；NCT02362048)阻断治疗后，均未观察到客观的肿瘤缓解，这提示单独的PD-1或PD-L1阻断治疗并不能对胰腺癌产生良好治疗效果。

2.2.2嵌合抗原受体T细胞治疗 嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)由单克隆抗体的可变区(Single chain variable fragment ，ScFv)、铰链区与TCR受体的跨膜区、胞内信号转导区串联而成，通过病毒感染或电转等方式使其表达在T细胞表面就构建成了CAR-T细胞。CAR-T可以直接识别肿瘤细胞表面的抗原，而不受HLA分子的限制。因此，CAR-T在肿瘤的免疫治疗中具有更加广阔的应用前景。

针对胰腺癌高表达的肿瘤相关抗原设计靶点特异性的CAR-T细胞，使治疗更具特异性。(1)Tn MUC-1 CAR-T：Posey等设计了靶向MUC-1上Tn/STn糖肽表型的CAR-T细胞，由于Tn MUC-1仅在肿瘤组织表达而在正常组织中不表达，降低了脱靶效应的风险，使靶向性更强。通过体外实验证明Tn MUC-1 CAR-T细胞经MUC1-9Tn刺激后能产生大量IL-2和IFN-γ，而非糖基化的MUC1-60-mer却不能刺激Tn MUC-1 CAR-T细胞活化。Hs766T人胰腺癌异种移植小鼠经Tn MUC-1 CAR-T治疗后，与未修饰的T细胞治疗组相比生存期由40 d提高到113 d且存活率达100%，同时观察到Tn MUC-1 CAR-T在肿瘤中大量聚集[31,32]。(2)CEA CAR-T：Panc02 CEA+人胰腺癌异种移植小鼠经CEA CAR-T细胞治疗后，小鼠肿瘤体积明显减小，其中67%小鼠肿瘤消除且未产生过度免疫反应。给小鼠再次转输CEA+C15A3胰腺癌细胞时，癌细胞很快被清除且血清中IL-1β和IL-5水平明显升高[33]。(3)PSCA CAR-T：PSCA同样是胰腺癌高表达的肿瘤相关抗原，靶向PSCA的CAR-T对人胰腺癌异种移植小鼠治疗后，抗肿瘤作用效果明显，其中40%小鼠肿瘤完全消退[34]。(4)MSLN CAR-T：Hingorani等设计了靶向MSLN的CD8+CAR-T细胞，通过体外实验发现，MSLN CAR-T细胞能特异性杀伤KPC肿瘤细胞并产生大量IFN-γ。KPC胰腺癌小鼠转输MSLN CAR-T细胞4 d后，检测到肿瘤内有CAR-T细胞浸润，8 d后肿瘤细胞出现凋亡。再次转输MSLN CAR-T细胞后，肿瘤中浸润T细胞数量是未修饰的T细胞治疗组小鼠的10倍，癌细胞转移率由64%降到46%，总体生存期由54 d升到96 d[35]。目前，MSLN CAR-T治疗(NCT01897415)及MSLN CAR-T与化疗药物联合应用治疗(NCT02465983)都处于Ⅰ期临床试验阶段。

胰腺癌独特的肿瘤微环境使传统的治疗方法效果不佳，单一的免疫治疗效果也不理想。例如，肿瘤疫苗虽能诱导效应T细胞的活化，但活化程度十分有限，且胰腺癌患者肿瘤微环境及外周血中仅有少量效应T细胞及NK细胞存在；免疫卡点阻断治疗虽能从细胞接触依赖性蛋白途径阻断对效应T细胞的抑制作用，但胰腺癌的肿瘤微环境仍存在众多的可溶性免疫抑制因子抑制效应T细胞功能；对于CAR-T治疗，CAR-T细胞除受肿瘤微环境中免疫抑制因素影响外，胰腺癌细胞周围的纤维基质层能阻碍CAR-T向肿瘤内浸润，影响疗效。因此，深刻理解胰腺癌免疫微环境的特点及其对免疫治疗的影响，将不同的纠正免疫抑制微环境的策略联合或与常规放化疗联合应用，将会大大改善胰腺癌的治疗效果。例如，免疫检查点阻断治疗与放、化疗及肿瘤疫苗的联合应用能增强肿瘤特异性T细胞的功能，促进淋巴细胞浸润到肿瘤部位。抗CD40激动剂能够逆转胰腺癌小鼠对PD-1和CTLA-4阻断抗体的耐受，提高阻断抗体的治疗效果。PD-1阻断抗体(pembrolizumab)及CTLA-4阻断抗体(nivolumab)与放射治疗联合应用能显著延长胰腺癌小鼠的生存期[36]。

3 展望

胰腺癌富含致密基质及具有免疫抑制作用的肿瘤微环境，为胰腺癌的发生、发展及远端转移创造了有利条件。肿瘤微环境中各组成部分间的密切联系和相互作用，也为胰腺癌的治疗带来了难度。因此，针对胰腺癌肿瘤微环境的特点设计合理免疫治疗策略，提高胰腺癌免疫治疗效果，应从以下几个方面着手：(1)破坏胰腺癌肿瘤的纤维基质层，增加效应T细胞向肿瘤内浸润；(2)清除过多的Tregs和MDSCs等免疫抑制细胞，逆转免疫抑制微环境；(3)招募更多T细胞到肿瘤部位，增强效应T细胞的抗肿瘤免疫反应；(4)增强效应T细胞的靶向性和杀伤性。