刘健 章平衡 黄旦 万磊 纵瑞凯

【摘 要】 成纤维细胞是类风湿关节炎滑膜组织中最主要的细胞，也是学者们研究类风湿关节炎发病机制与药物治疗的重要对象。近年来，随着中医药事业的日益发展，越来越多的学者着手中药及其有效单体对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖和凋亡的机制研究，并收到一些成效。通过近年来中药及其单体对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡研究进行综述，为后期研究奠定基础和提供思路。

【关键词】 关节炎，类风湿；中药；单体；增殖；凋亡；综述

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以四肢大小关节对称性关节滑膜炎症为主要临床特征的慢性自身免疫性疾病。其主要的病变部位在关节滑膜，表现为滑膜的炎症、滑膜血管翳的形成、滑膜的增厚及纤维化样改变。滑膜的长期炎症刺激及血管翳生成，会导致滑膜异常增生、关节下骨与软骨的破坏，最终导致关节畸形、功能障碍等。然而，细胞的增生和凋亡是机体正常的生命活动，在正常情况下应处于动态平衡的状态。但在某些外界因素的刺激下，则会导致两者之间失衡。RA滑膜成纤维细胞的抑制凋亡因素与促凋亡因素的失调，最终表现为滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的失衡。目前，很多学者对RA滑膜成纤维细胞的凋亡机制展开了研究，试图探讨其凋亡的分子作用机制，收获颇多。而对于RA的治疗一直并无较好的方法。近年来，中医药事业的发展为RA的治疗增添了一丝新的希望。很多学者从RA滑膜成纤维细胞的凋亡角度出发，用中药及中药有效单体进行干预，取得了一定的成果，但仍需大量临床试验研究加以证实。本文就中药及中药有效单体对RA细胞增殖与凋亡的相关研究进行综述。

1 影响RA增殖和凋亡的中药复方

RA是一种难治性的慢性自身免疫性疾病，病情容易反复发作，缠绵难愈。西药治疗RA主要用非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药，其疗效局限，不良反应颇多，不能很好地改善预后及提高患者生活质量。中药能有效改善RA预后，提高患者生活质量。近年来，有大量研究着手于中药复方对RA的治疗，并就其对RA滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的作用进行了探究。刘健等[1-3]

采用弗氏完全佐剂造成佐剂性关节炎（AA）大鼠模型研究RA的凋亡，采用Annexin V/PI法、TUNEL法和线粒体膜电位（MMP）标记法检测大鼠滑膜细胞、胸腺细胞、胃黏膜细胞的凋亡率，运用透射电镜法观察凋亡细胞的形态学变化，并利用免疫组化法检测Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达水平，结果发现，新风胶囊干预的大鼠滑膜细胞核染色质呈凝块状，边聚呈月芽状，胞浆内及胞膜外可见凋亡小体，并对胸腺细胞、胃黏膜细胞也有促进凋亡作用；研究还证明新风胶囊能够上调Fas、FasL的表达量，下调Bcl-2的表达量[4]。进一步临床研究发现，新風胶囊还能够通过增加RA患者CD4+T细胞凋亡水平[5]，上调Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、Bax的表达量，下调Bcl-2的表达量，并且这些凋亡基因蛋白水平与RA疾病活动性指标密切相关，其可能的分子学机制在于新风胶囊通过调控Fas/FasL细胞凋亡通路，调节细胞凋亡相关蛋白的表达，促进细胞凋亡[6-7]。高晓鹏等[8]将独活寄生汤含药血清分为高、中、低剂量对体外RA模型大鼠滑膜成纤维细胞进行干预，发现随着药物作用时间的延长，滑膜成纤维细胞的增殖受到抑制并呈剂量依赖性，独活寄生汤能够升高促凋亡Bax、Caspase-3蛋白和降低抑制凋亡Bcl-2蛋白含量。风湿痹痛方具有祛风散寒除湿、祛瘀通络止痛、补肝益肾的功效，治疗RA有较好的疗效，通过对RA模型大鼠的干预发现，其能够提高Caspase-8表达，影响sFas/sFasL，促进细胞凋亡，减少关节损伤[9]。另有研究采用柱前衍生化反相高效液相色谱法，选出蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度，对RA滑膜成纤维细胞进行体外干预，结果表明，蕲蛇煮散剂具有诱导RA滑膜成纤维细胞凋亡的作用[10]。有研究用不同浓度的断藤益母汤处理RA成纤维样滑膜细胞，发现其能够抑制RA成纤维细胞的活力，并通过抑制PI3K/AKT信号通路的活化，促进RA成纤维样滑膜细胞的凋亡[11]。黄芪虫藤饮对RA G0/G1期滑膜细胞有抑制期增殖的作用，并能够促进RA滑膜细胞的凋亡[12]。金乌健骨方能够减轻胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠足趾关节肿胀度，降低血清中炎性细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1及IL-1β的表达，减少滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润，从而抑制RA滑膜细胞的肿瘤样增生，并通过NF-κB p65、IKK-α及IKK-β的表达水平，促进滑膜细胞凋亡[13-14]。桂枝芍药知母汤通过促进凋亡蛋白Bcl-2、p53下降，升高Fas抗原表达，从而促进RA滑膜细胞凋亡，促进机体内平衡[15]。黄芪桂枝五物汤能够升高CIA模型大鼠关节滑膜细胞的Bcl-2蛋白水平，降低Bcl-xl蛋白水平，促进过度增生的滑膜细胞凋亡[16]。

2 中药单体对RA滑膜成纤维细胞的增殖和凋亡机制的影响

2.1 青藤碱（sinomenine，SN） SN是从中药青

风藤中提取的主要有效单体，其分子结构式为C19H23NO4。研究表明，SN对RA滑膜成纤维细胞的增殖具有明显抑制作用，并且在体外培养的RA滑膜成纤维细胞实验中发现，SN对滑膜成纤维细胞的细胞周期G1～S期具有明显的阻滞作用，并且这一作用发生在细胞凋亡之前，说明SN能够抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖，促进细胞凋亡。另有研究证明，SN对RA滑膜细胞凋亡具有剂量依赖性[17]。SN对RA滑膜成纤维细胞的增殖及凋亡的机制可能是通过抑制NF-κB p65亚基核转位及NF-κB的DNA结合活性，从而抑制RA滑膜细胞的炎性增殖[18]。SN通过下调凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，从而阻滞滑膜细胞G1期细胞向GS期移行，促进细胞凋亡[19]。也有可能通过抑制Toll样受体、MyD88、TRAF-6的表达水平，减轻对MAPK信号通路的刺激和抑制NF-κB的活化，进而导致RA滑膜细胞的凋亡和增殖[20]。

2.2 雷藤舒（LLDT-8） LLDT-8是一种新发现的雷公藤有效单体，即（5R）-5-羟基雷公藤内酯醇。研究将50 nmol·L-1的LLDT-8体外干预TNF-α诱导RA滑膜成纤维细胞，其能够抑制滑膜成纤维细胞分泌IL-6、基质金属蛋白酶-3（MMP-3），下调凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达，最终实现抑制凋亡信号通路Bcl-2的活化，达到调控RA滑膜成纤维细胞凋亡的目的[21]。另外有研究表明，LLDT-8可抑制TNF-α联合IL-17诱导的RA滑膜成纤维细胞分泌IL-6和IL-8，通过抑制TNF-α联合IL-17诱导的RA滑膜成纤维细胞的NF-κB信号通路异常活化，从而抑制RA滑膜细胞炎症反应，抑制滑膜细胞增殖，实现细胞凋亡的发生[22]。

LLDT-8还可上调RA患者体内CD3+T淋巴细胞中骨保护素（OPG）的表达，抑制促炎细胞因子IL-6、IL-21、IL-23等分泌，促进抑炎细胞因子IL-10分泌，调节RA患者体内RANKL-RANK-OPG系统，并通过抑制RANKL下游的NF-κB信号转导通路，促进破骨细胞凋亡，抑制滑膜细胞增殖，最终起到抗RA骨破坏的作用[23]。

2.3 白藜芦醇（resveratrol，Res） Res是一种提取于决明子、虎杖、藜芦等中药的有效单体，其化学名为3，5，4'-三轻基-反-均二苯代乙烯[24-25]。有研究将RA患者膝关节滑膜组织进行体外培养，并用不同浓度的H2O2处理24 h后，发现其呈现剂量依赖性地促进RA滑膜成纤维细胞增殖，后用不同浓度Res（0，5，20，50，100 μmol·L-1）诱导低浓度H2O2处理的RA滑膜成纤维细胞，发现RA滑膜成纤维细胞随着Res浓度的不断升高，其细胞凋亡呈现增加趋势；并同时检测了自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅰ/Ⅱ的表达，发现均呈剂量依赖性降低，Res通过抑制自噬通路的活化，下调自噬通路相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1的表达水平，从而促进RA滑膜成纤维细胞的凋亡[26]。同时Res还能够抑制滑膜细胞氧化应激通路的活化，下调Foxo1、Foxo4基因表达，抑制凋亡蛋白Bax表达，上调促凋亡蛋白Bcl-2表达，促进RA滑膜成纤维细胞的凋亡[27-28]。另有研究证明，Res通过诱导激活凋亡相关的信号通路Caspase-3，并抑制细胞线粒体中Bad、p-Bad蛋白的表达，最终实现RA滑膜细胞的凋亡[29]。

2.4 汉黄芩素（wogonin，Wog） Wog是一种提取自黄芩的有效单体，是黄酮类化合物的一种，目前被证实具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等功效[30]，并能够促进多种细胞的凋亡，如胃癌SGC7901细胞[31]、肝癌HepG2细胞、白血病SUP-B15和Jurkat细胞[32]。研究表明，Wog能够抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖，呈剂量依赖性；其还能够降低滑膜细胞中MMPs、IL-6的表达水平，增加滑膜细胞内活性氧水平，从而诱导活化p38MAPK信号通路，上调p-p38MAPK蛋白水平，使p38MAPK蛋白表达含量明显增加，最终导致RA滑膜成纤维细胞的凋亡[33-34]。

2.5 白花丹素（plumbagin，PLB） PLB是蓝雪科蓝雪属植物白花丹的一种有效成分，具有抗病毒、抗风湿、抗免疫等多种功效。既往大量研究发现PLB对多种疾病均有治疗作用，并且对多种细胞有促进凋亡功效[35-36]。最新研究发现，其对RA滑膜成纤维细胞也具有调控作用[37]。刘玉等[38]用PLB干预体外分离并传代的RA滑膜成纤维细胞，并对细胞的形态及其细胞内与凋亡相关的蛋白进行检测，发现PLB对RA滑膜成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用，并能够抑制其分泌炎性細胞因子，上调促凋亡蛋白水平，下调抑制凋亡相关蛋白表达水平，认为PLB对RA细胞凋亡作用的分子机制可能是通过下调p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达，从而抑制JAK2/STAT3信号通路的活化，抑制滑膜成纤维细胞分泌大量炎性细胞因子，进一步上调Bax、cleaved Caspase-3凋亡蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平，从而导致RA滑膜成纤维细胞凋亡的发生，最终表现为细胞变圆变小，细胞萎缩，细胞学形态改变，直至死亡。

3 总 结

由上述可见，目前已有大量关于中药及中药有效活性单体成分对RA滑膜细胞凋亡的研究。其主要作用机制体现在对RA滑膜细胞增殖的抑制作用，对RA滑膜细胞及外周血单个核细胞的促凋亡作用，抑制滑膜细胞炎性细胞因子的分泌及与纤维化相关的MMPs的表达，抑制软骨细胞的降解和破骨细胞的生成，防治关节滑膜及软骨的破坏等。作用的分子机制莫过于对NF-κB、JAK/STAT、p38MAPK等与凋亡相关的信号通路调控，进而达到对促凋亡基因Bcl-2水平的上调，对抑制凋亡基因Bcl-xl、Bax、Caspase等水平的下调，从而最终实现细胞凋亡的发生。虽然它们的作用分子机制和靶点各不相同，但均取得了相应的成效，为中医药治疗RA提供了新方法和诊疗思路。现代科技及分子生物学技术的不断发展，为中医药治疗RA提供了更好的平台。中药有效单体治疗RA仍存在不足，如大部分研究基于动物实验，但毕竟存在种属差异，其对动物有效，而对人体可能无效。其次，仅用中药有效活性成分为研究对象，则不能很好地体现中医的君臣佐使配伍理念，也很难与中医的辨证论治整体观念相结合。因此，如何将现代分子生物学技术的中药有效单体靶向治疗与中医理论体系相统一，并使其更好地服务于中医，更切合于中医理论的现代中医研究方法是今后研究的重点。

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收稿日期：2018-09-20；修回日期：2018-10-15