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透骨消痛胶囊对兔膝骨质疏松性骨关节炎模型软骨与软骨下骨结构的影响

2018-01-19张佳慧,陈赛楠,陈文列,黄云梅,林如辉,黄美雅,吴银生,郑良朴,李钻芳,刘献祥

风湿病与关节炎 2017年12期
关键词:骨关节炎软骨

张佳慧,陈赛楠,陈文列,黄云梅,林如辉,黄美雅,吴银生,郑良朴,李钻芳,刘献祥

【摘 要】目的:观察透骨消痛胶囊对骨质疏松性骨关节炎模型软骨与软骨下骨结构的影响,为探讨治疗该类型骨关节炎提供依据。方法:将18只新西兰大白兔分为正常组、模型组、中药组。除正常组外,其余2组先诱导骨质疏松,再建立膝骨关节炎模型。正常组与模型组给予生理盐水,中药组给予透骨消痛胶囊灌胃4周。HE和番红-固绿染色,光镜观察软骨结构;显微CT观察软骨下骨,分析骨小梁参数;扫描电镜观察软骨下骨微细结构。结果:模型组软骨损伤,基质蛋白多糖浅染,Mankin评分达中期损伤;软骨下骨骨小梁结构破坏,参数变化;胶原纤维等微细结构损伤。中药组软骨损伤减轻,基质深染,Mankin评分为早期损伤;软骨下骨骨小梁结构和参数改善;胶原纤维等微细结构改善。结论:透骨消痛胶囊能改善骨质疏松性骨关节炎模型软骨结构与基质病变,减轻软骨下骨微结构破坏,故可延缓该类型骨关节炎病理进程。

【关键词】 骨关节炎;骨质疏松性骨关节炎;透骨消痛胶囊;软骨;软骨下骨;兔

Intervention of Tougu Xiaotong Jiaonang(透骨消痛胶囊)in Cartilage and Subchondral Bone Structure of Rabbit Models with Osteoporotic Osteoarthritis in Knees

ZHANG Jia-hui,CHEN Sai-nan,CHEN Wen-lie,HUANG Yun-mei,LIN Ru-hui,HUANG Mei-ya,WU Yin-sheng,

ZHENG Liang-pu,LI Zuan-fang,LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective:To observe the effects of Tougu Xiaotong Jiaonang(透骨消痛胶囊)on cartilage

and subchondral bone structure of rabbit models with osteoporotic osteoarthritis in knees to provide the basis for the treatment of this type of osteoarthritis.Methods:Eighteen New Zealand white rabbits were divided into a normal group,a model group and a Chinese medicine group.Except for the normal group,osteoporosis were induced in the other two groups to establishing models with knee osteoarthritis.The normal group and the model group were given normal saline,while the Chinese medicine group was given intragastric administration of Tougu Xiaotong Jiaonang for 4 weeks.After HE and safranine fast green staining,the cartilage structure was observed under the light microscopy.Micro CT was used to observe the subchondral bone to analyze the trabecular bone parameters.The subchondral bone microstructure was observed with scanning electron microscope.Results:In the model group,the cartilage was damaged,the matrix proteoglycan was understained,and Mankin score showed the medium-term injury.The subchondral bone trabecular structure was destructed and the parameter changed.Fine structures such as collagen fiber were damaged.In the Chinese medicine group,the cartilage damage was relieved,the matrix was deeply stained,and the Mankin score showed early damage.The trabecular bone structure and parameters were improved.The collagen fiber and other fine structures were also improved.Conclusion:Tougu Xiaotong Jiaonang can improve the cartilage structure and matrix lesions in models with osteoporotic osteoarthritis and reduce the damage to subchondral bone microstructure to delay the pathological process of this type of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;osteoporotic osteoarthritis;Tougu Xiaotong Jiaonang(透骨消痛膠囊);cartilage;endprint

subchondral bone;rabbits

骨关节炎(osteoarthritis,OA)的特征为软骨变性、软骨下骨破坏、骨赘增生等[1]。骨质疏松(osteoporosis,OP)表现为骨强度受损、骨组织微结构损坏、骨脆性增加[2]。临床上存在OP性OA,其特征是软骨下骨疏松易脆,被持续增加骨重塑诱导并导致软骨下微骨折和磨损,从而加速OA发展,而且随着年龄增加,OP性OA发生率不断增加[3-4]。目前的研究较少关注OP性OA,大多数研究仅集中在OA的软骨结构变化或OP的软骨下骨结构变化[5-6]。而关节软骨和软骨下骨之间又存在密切的生物力学关系,软骨下骨的力学性能可影响关节软骨的完整性,引发软骨退变[7-8]。因此,研究OP性OA中软骨和软骨下结构变化具有重要意义。

中医学认为,OA与OP两者均以肾虚为本,均是全身退行性改变,补肾法能够有效治疗OA和OP[9]。透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎、肿节风组成,具有补肾柔肝、活血祛风等功效,长期用于临床治疗OA疗效显著[10]。前期研究表明,透骨消痛胶囊能减轻软骨损伤[11],促进成骨细胞的增殖和骨钙素的分泌[12];能改善软骨下骨重塑和硬化[13]。故根据肾虚是OA和OP的共同病机,该药对OP性OA也可能有药效作用,但对OP性OA干预作用尚未见报道。本实验拟通过透骨消痛胶囊干预OP性OA模型,观察软骨与软骨下骨结构变化,为探索在临床上使用该药治疗OP性OA的可能性提供实验与理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 18只6月龄普通级雌性新西兰大白兔,体质量1.8~2.1 kg,由上海市松江区松联实验动物场提供,动物许可证号:SCXK(沪)2012-0011。动物饲养于福建中医药大学实验动物中心,使用许可证号:SYXK(闽)2009-0001。

1.2 实验药物和儀器 透骨消痛胶囊(福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂,闽制字Z20100006);光学显微镜(德国徕卡公司);小动物显微CT(广州中科恺盛医疗科技有限公司);台式扫描电镜(日本日立高新技术公司)。

2 方 法

2.1 动物分组与模型制备 将18只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、中药组,每组6只。除正常组外,其余2组以质量分数为3%的戊巴比妥钠按30 mg·kg-1剂量耳缘静脉注射麻醉,手术切除双侧卵巢诱导OP[14]。4周后,采用改良Hulth法[15]建立右膝OA模型,切断内侧副韧带,完整摘除内侧半月板,切断前交叉韧带。手术后1周,每日强迫动物活动30 min,连续4周,建立OP性OA模型。

2.2 动物给药与取材 OP性OA模型建立后,中药组用透骨消痛胶囊1.86 g·kg-1·d-1灌胃,正常组与模型组用等量生理盐水灌胃,每日1次,连续4周。用药结束后,采用空气栓塞法处死实验动物,取右膝股骨、胫骨,置于质量分数为4%的多聚甲醛中。

2.3 软骨HE染色观察 股骨经质量分数为4%的多聚甲醛固定3 d,质量分数为10%的EDTA脱钙16周,取股骨内髁沿矢状面切开,再用乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。石蜡切片4 μm,脱蜡至水,苏木素染色30 min,分化,伊红速染1 s,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察软骨组织病理变化、摄影。

2.4 软骨番红-固绿染色观察 股骨切片脱蜡,用质量分数为1%的番红染色10 min,质量分数为0.02%的固绿染色3 min,体积分数为95%的乙醇分化3 s,质量分数为1%的番红复染3 min,透明、封片,光镜观察、摄影。

2.5 软骨Mankin评分 根据HE染色、番红-固绿染色,参照Mankin评分标准[16],评估软骨病变程度,根据软骨表面结构、细胞排列、番红染色程度、潮线完整性等进行病程分期,1~5分为早期OA,6~9分为中期OA,10~14分为晚期OA。

2.6 软骨下骨Micro-CT观察 经质量分数为4%的多聚甲醛固定的胫骨,置于Micro-CT检查槽,沿胫骨长轴方向扫描,条件为电压60 KV、电流666 μA、功率40 W,分辨率50 μm,扫描30 min,

图像二值化。扫描图片后三维重建,分别观察软骨下骨胫骨平台、矢状面、横断面,并选择胫骨软骨下骨相同图像位置的感兴趣区域,进行骨小梁参数分析,包括骨密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨体积分数(BV/TV)。

2.7 软骨下骨扫描电镜观察 Micro-CT观察后,于胫骨内侧1/3处用刀片断开;先后用PBS、蒸馏水充分清洗骨髓腔,再用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的叔丁醇脱水,真空干燥后将样本定向固定于载物台,台式扫描电镜下观察。

2.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示,正态性分布采用单因素方差分析,方差齐采用LSD检验;非正态性分布采用非参数Kruskal-Wallis检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨显微结构 正常组软骨表面光滑平整,细胞数量较多,排列整齐。模型组软骨表面粗糙有裂隙、纤维增多,细胞数量弥漫性增多,有簇集样细胞团,排列混乱。中药组软骨损伤程度较模型组轻,表面较光滑,细胞排列较整齐,数量略增加。见图1。

3.2 软骨蛋白多糖 番红能与酸性蛋白多糖结合,将软骨基质染成粉红色;固绿可与含碱性氨基酸的胶原纤维结合将软骨下骨染成蓝绿色[17]。正常组软骨基质被染成均匀粉红色,蛋白多糖较丰富;软骨放射层与钙化层交界的潮线清晰可见;软骨下骨胶原纤维被染成蓝绿色,钙化层与软骨下骨板分界的黏合线清晰,呈锯齿状。模型组软骨基质番红染色重度减退,蛋白多糖较少;可见潮线不齐;黏合线呈波浪状。中药组软骨基质番红染色加深,甚至深于正常组,蛋白多糖丰富;潮线可见;黏合线也呈波浪状。见图2。endprint

3.3 3组软骨Mankin评分比较 与正常组比较,模型组Mankin评分增加(P < 0.01),表明软骨损伤增加,属于中期OA;与模型组比较,中药组Mankin评分降低(P < 0.05),表明软骨损伤减轻,为早期OA。见表1。

3.4 软骨下骨微结构Micro-CT观察 从胫骨平台结构三维重建图可见,正常组胫骨平台表面平整、光滑,未见骨赘形成。模型组胫骨平台表面粗糙不平,边缘有骨赘凸起。中药组胫骨平台表面不平整,边缘有比模型组小的骨赘。见图3。

从矢状面结构三维图可见,正常组软骨下骨骨小梁排列整齐、连接性好;骺端Tb.N较多。模型组软骨下骨骨小梁排列混乱,间距较大,部分断裂;骺端骨小梁大量消失。中药组软骨下骨骨小梁排列较为整齐、均匀;骺端Tb.N较模型组增加。见

图4。

从横断面二维图可见,正常组骨小梁从四周向中部排列均匀有序,呈均匀网状交织结构。模型组边缘骨小梁排列无序紊乱,局部致密增生,部分扭曲断裂,边缘有骨赘。中药组骨小梁排列较整齐,局部骨小梁少量增加,无明显断裂,连接性较好,仍可见交织网状结构,边缘一侧有部分骨赘,骨小梁结构较模型组改善,接近正常组结构。见图5。

3.5 3组软骨下骨骨小梁参数比较 与正常组比较,模型组BMD、Tb.Th和BV/TV显著降低(P < 0.05

或P < 0.01),Tb.N、Tb.Sp均发生变化;与模型组比较,中药组的BV/TV显著增加(P < 0.05),BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改善,且较接近正常组水平。见表2。

3.6 软骨下骨微细结构扫描电镜观察 从骨小梁结构图可见,正常组软骨下骨骨小梁呈不规则立体网状结构,连接性好,未见明显断裂,与软骨下骨板连接处结构完整,能起到吸收应力作用。模型组软骨下骨骨小梁部分断裂、疏松,网状结构被破坏,吸收应力作用减弱。中药组骨小梁结构较模型组改善,未见明显断裂,仍可见部分网状结构,与软骨下骨板连接处较为完整,能起到一定的吸收应力作用。见图6。

从胶原纤维结构图可见,正常组断面较光滑,胶原纤维及其结合的钙-磷等骨盐致密紧实。模型组断面粗糙,胶原纤维及骨盐松散且有裂隙。中药组断面较光滑,胶原纤维间致密但有裂隙。见图7。

4 讨 论

在中医学中OA属“骨痹”范畴,OP属“骨痿”范畴,病位均在骨,为肾脏所主,而肝肾两脏关系密切,因此两者的病机都是肝肾亏虚[18]。从西医学来看,中医的肾还关系着分泌、代谢、免疫等功能,对人体生长、发育有重要调节作用;临床上使用补肾中药治疗OP性OA,具有提高骨密度、改善疼痛等作用[9]。因此,本研究使用补肾柔肝中药透骨消痛胶囊干预OP性OA,可为临床治疗提供实验依据。

关于OP性OA模型的造模方法,曾报道通过双侧卵巢切除术并增加皮质类固醇诱导OP模型后,再切断前交叉韧带和摘除内侧半月板手术诱导OA,建立复合模型[8],但皮质类固醇可能会导致软骨损伤[19]。因此,我们采用双侧卵巢切除术和膝关节手术的造模方法[14,20]诱导OP性OA

模型。

软骨退变是OA最主要的病理变化,基质中蛋白多糖能吸引水分子嵌在构成软骨网架结构的胶原中,保持软骨的黏弹性;OP性OA发生时,胶原降解,蛋白多糖减少,引起软骨细胞功能改变,导致软骨退变[14,21]。研究显示,透骨消痛胶囊能明显增加蛋白多糖,甚至高于正常组,这表明中药可能是通过促进蛋白多糖的合成分泌,改善软骨基质成分,维持软骨细胞正常生存环境,并保持软骨黏弹性,从而有利于软骨修复,改善软骨结构,减轻软骨损伤,延缓软骨退变,从而使中期OA减轻至早期。

软骨下骨可分为软骨下骨板和骨小梁两部分。软骨下骨板是薄的皮质骨,位于钙化软骨深处;骨小梁彼此连接形成网状,起吸收应力、缓冲震荡和支撑作用[22]。骨小梁的稳定性和强度与其微结构的形态有关,如骨小梁的形态、连接方式和胶原纤维的走向、排列等[23]。模型组软骨下骨胶原纤维粗糙松散,骨小梁疏松、断裂,骨小梁参数分析显示骨量降低,说明该区域对抗机械压力降低,并显示出较明显畸形,导致机械性能改变,这可能与卵巢切除后雌激素水平下降、骨转换率升高、骨吸收增加有关。

中藥组与模型组相比,胶原纤维致密紧实,骨小梁排列较有序,骨小梁参数分析显示骨量增加等,说明透骨消痛胶囊能抑制OP性OA软骨下骨OP,改善软骨下骨机械性能。这可能与中药抑制骨吸收,促进骨形成,促进胶原纤维的修复,改善软骨下骨骨小梁的微结构,从而维持其吸收应力作用,与恢复软骨下骨生物力学作用有关。软骨下骨参数改善若要全部达到统计学差异,可能需延长治疗时间,或是提前给药。

近年来研究发现,软骨下骨改变、软骨下骨与软骨之间的相互作用,在OP性OA中有着重要作用[14]。软骨下骨结构的改变可能导致机械荷载应力的变化,会将更多的负荷传递给上面的软骨,导致软骨损伤和退变进一步加重[22]。软骨下骨OP,会使得骨组织微骨折增加,反复多次微骨折会损伤骨组织机械性能,使生物力学强度下降,关节软骨发生损伤[24],最终加速OP性OA发展。透骨消痛胶囊可能通过改善软骨下骨结构和机械性能,减轻过度负荷传递给上面软骨,从而延缓软骨退变。

综上所述,透骨消痛胶囊一方面通过促进蛋白多糖合成分泌,减轻软骨结构损伤,延缓软骨退变;另一方面通过改善软骨下骨胶原纤维、骨小梁的微结构,提高骨量,改善软骨下骨的结构和机械性能,反过来又减轻软骨下骨上方软骨的负荷,保护软骨。本研究结果说明,透骨消痛胶囊可改善兔膝OP性OA的软骨和软骨下骨结构,维持其机械性能、延缓病理进程,提示可在临床上扩展用于治疗OP性OA,并可用于预防性用药防止因OP导致的OA形成与发展。

5 参考文献

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收稿日期:2017-06-14;修回日期:2017-08-03endprint

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