田丙正 张敏+张付海+赵彬+王鑫+朱超

摘要建立了固相萃取高效液相色谱二极管阵列检测器法测定湖水中10种蓝藻毒素（MCRR、MCYR、MCHtyR、MCLR、MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF和NOD）的方法。水样经固相萃取净化后，用Waters PAH C18 （250 mm×46 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈和含005%三氟乙酸为流动相梯度洗脱，流速为08 mL/min， 柱温为30℃，进样量为20 μL，二极管阵列检测器检测范围190～300 nm，检测波长为238 nm。根据保留时间、二极管阵列检测器全扫描光谱和色谱峰纯度分析等进行定性分析。10种蓝藻毒素在005～200 mg/L浓度范围内线性关系良好，线性系数R为09998～09999，方法检出限为0005～0020 μg/L。3个浓度加标水平（01、10和18 mg/L）的回收率为851%～1053%，相对标准偏差为08%～92%。本方法适用范围广、操作简单、分析速度快、灵敏度高、重现性和回收率好，采用多重定性增强了定性分析的准确性，可用于实际湖水中10种蓝藻毒素的测定。

关键词高效液相色谱； 二极管阵列检测器； 固相萃取； 蓝藻毒素； 水

1引 言

随着环境污染和水体富营养化程度加剧，水体中有害藻类水华尤其是蓝藻水华频繁发生。世界上25%～70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素[1]，其在水环境中的污染特征[2，3]和对人体健康危害[4]一直备受关注。蓝藻毒素分为肝毒素[5]、神经毒素[6]和其它毒素，其中肝毒素又包括微囊藻毒素（Microcystin，MC）、节球藻毒素（Nodularin，NOD） [7]和柱孢藻毒素（Cylindrospermopsin，CYN） [8]。在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素[9]，微囊藻毒素目前已发现90多种异构体[10]，其污染已经成为全球性的环境问题[11]。节球藻毒素致毒机理与微囊藻毒素相似，中毒症状和危害也类似。

蓝藻毒素的检测方法主要有酶联免疫法[12]、分子生物学法[13]、高效液相色谱法[14]和液相色谱质谱联用法[15～17]等。酶联免疫法专属性不强，只能测定藻毒素总量，无法识别MC个体；分子生物学法检测易出现假阳性结果；液相色谱串联质谱法灵敏度高，但仪器昂贵、普及率不高、操作繁琐，检测成本高。二极管阵列（PDA）检测器兼顾了高灵敏度和准确度，Edwards等[18]发现二极管阵列检测器对微囊藻毒素进行纯度检测得到的结果更精确。液相色谱法较为普遍、简单快速，是世界卫生组织和我国推荐的标准分析方法。目前，世界卫生组织仅对水中微囊藻毒素MCLR的限量水平做出规定，其暂行限量值为0001 mg/L[19]，对于其它蓝藻毒素在水中的限量要求没有准则水平。我国在地表水环境质量标准（GB38382002）集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值中规定了微囊藻毒素LR限量值为0001 mg/L[20]，也未对其它蓝藻毒素做出规定。

目前，测定蓝藻毒素的方法主要还是只针对微囊藻毒素[21，22]或节球藻毒素[23]分别进行，研究多涉及微囊藻毒素，检测的微囊藻毒素种类有限；对节球藻毒素的分析研究很少。作为两类危害严重的藻毒素，微囊藻毒素和节球藻毒素的同时检测尤为重要，复杂的水体环境又要求检测尽可能多的藻毒素，目前使用液相色谱二极管阵列检测器法对微囊藻毒素和节球藻毒素的同时检测和多种类检测鲜有报道。本研究通过优化样品前处理和色谱条件，建立了固相萃取液相色谱二极管阵列检测器法同时测定湖水中10种蓝藻毒素的方法。本方法适用性广、操作简单、分析速度快、重现性好和灵敏度高，定性更可靠，定量更准确，为全面了解富营养化水体中蓝藻毒素的污染状况提供了科学的分析方法。

2实验部分

21仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括四元泵、在线真空脱气机、柱温箱、自动进样器和二极管阵列检测器（美国Waters公司）； MilliQ Integral 115超纯水系统（美国Millipore公司）；AQUA Trace ASPE 799固相萃取仪（日本ShimadzuGL公司）；MultiVap8全自动定量浓缩仪（美国LabTech公司）。Waters Oasis HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL，美国Waters公司）。三氟乙酸（TFA，色谱純，美国Dikma公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；10种蓝藻毒素标准品MCRR、MCYR、MCHtyR、MCLR、MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF和NOD（纯度≥995%，瑞士ENZO Life Sciences公司）。

22色谱条件

Waters PAH C18色谱柱（250 mm × 4 6 mm，5 μm）； 流动相A为005% TFA溶液，流动相B为乙腈。 梯度洗脱程序： 0～18 min， 31% B； 18～35 min， 31%～70% B； 35～36 min， 70%～31% B； 36～40 min， 31% B。 流速为08 mL/min； 柱温为30℃， 进样量为20 μL。 二极管阵列检测器检测范围190～300 nm， 带宽12 nm， 检测波长为238 nm。

23标准曲线溶液的配制

取10种蓝藻毒素标准品，用甲醇配制成浓度为10 mg/L的标准储备液，用20%甲醇溶液逐级稀释成005、020、050、100和200 mg/L的系列混合标准溶液。

24样品采集和前处理

采集湖泊湖区表层水样置于棕色玻璃瓶中，锡箔纸包裹后冷藏保存，当天送回实验室。先经500目不锈钢筛过滤，除去水样中浮游生物和悬浮物；再取过滤后的水样依次经GF/C玻璃纤维滤膜和045 μm乙酸纤维滤膜减压过滤。固相萃取程序：先将HLB固相萃取柱用10 mL甲醇和10 mL水活化，然后将1000 mL过滤水样以10 mL/min的流速在HLB柱上样，富集完毕后依次用10 mL水和10 mL 20%甲醇溶液淋洗，再用20 mL含01%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，洗脱液氮吹浓缩至近干，用1 mL 50%甲醇溶液定容后，过045 μm微孔滤膜，待测。endprint

25定性与定量分析

在样品与标准品的色谱保留时间定性基础上，与二极管阵列检测器全扫描光谱定性和色谱峰纯度分析相结合，采取多重定性方法。以外标法对10种蓝藻毒素进行定量分析。

3结果与讨论

31样品前处理条件的选择

311固相萃取（SPE）柱的选择水中蓝藻毒素的萃取和净化多采用C18柱和HLB柱[24]，本研究对比了Waters SepPak C18柱和Waters Oasis HLB柱对10种蓝藻毒素的提取效率，发现两者的平均提取率分别超过80%和85%，这是因为HLB固相萃取柱以N乙烯基吡咯烷酮二乙烯基苯共聚物为固定相，与多数有机溶剂兼容，稳定性好，吸附容量更高，保留能力更强。因此，本研究选择Waters Oasis HLB柱进行蓝藻毒素的萃取和净化。

312洗脱液的选择文献[24]报道，使用75%以上的甲醇洗脱液即可将目标物大部分洗脱下来，但100%甲醇洗脱MCRR的回收率近乎为0。本研究在100%甲醇中加入01% TFA作为洗脱液，发现10种蓝藻毒素的回收率均可达到90%以上。 这可能是加入TFA后，酸性条件可促进蓝藻毒素中多肽质子化，减少目标物与萃取柱表面的相互作用，更易洗脱，同时还会减少杂质洗脱， 降低色谱峰干扰，且在样品浓缩时由于没有水相，减少了浓缩时间。因此，本研究选择100%甲醇中加入01% TFA作为洗脱液。

32色谱条件的选择

321二极管阵列检测器多重定性和检测波长的选择水体环境复杂，样品基质可能与目标物共流出，保留时间相近，仅依据保留时间定性易出现假阳性结果。二极管阵列检测器可以得到紫外全波长扫描图，用于确证蓝藻毒素的存在和鉴定其种类。比较二极管阵列检测器待测样品和蓝藻毒素标准品的扫描光谱图和最大吸收波长，还可进行色谱峰纯度分析，采取多重定性分析方法，增强定性分析的准确性，排除基质干扰和假阳性结果。

利用二极管阵列检测器的在线3D扫描功能，在190～300 nm范围内对10种蓝藻毒素进行紫外吸收扫描。结果表明，MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR和MCWR的紫外全波长扫描图基本相同，特征紫外吸收波长在232～240 nm；MCLA和MCLY的紫外全波长扫描图与上述6种差别较大，特征紫外吸收波长在238 nm附近；MCLW和MCLF的紫外全波长扫描图相互差别较小，其中MCLW在225和240 nm有两个特征吸收波长，MCLF的特征吸收波长为239 nm。10种蓝藻毒素在波长238 nm附近有较强的紫外吸收，故本研究选择238 nm作为10种蓝藻毒素通用的定量检测波长。

322色谱柱的选择高效液相色谱法常用的反相色谱柱多为C18柱，由于MCYR和MCHtyR疏水性非常接近，使用普通C18色谱柱无法实现有效分离[14]。本研究采用了Waters PAH C18色谱柱（250 mm × 4 6 mm， 5 μm）对10种蓝藻毒素进行分析，结果表明，此色谱柱可将MCYR和MCHtyR有效分离，且分离度较好，其它目标物也分离良好，色谱峰对称且基线平稳。

323流动相体系的選择高效液相色谱测定蓝藻毒素的流动相体系一般由乙腈/水或甲醇/水和缓冲溶液组成。通过比较乙腈/水和甲醇/水两种体系发现，乙腈的基线噪音更小，分析时间更短，分离效果更佳，因此选用乙腈/水作为流动相体系。由于蓝藻毒素呈中性或带有负电荷，使用缓冲液保持流动相酸性，可抑制蓝藻毒素电离，改善峰形，增加响应值，提高分离效果。本研究分别以三氟乙酸和磷酸盐作为缓冲溶液进行对比实验，结果表明，两种缓冲液条件下10种蓝藻毒素均能较好分离。流动相中加入TFA，分离度更好，基线更稳定，作为离子对可促进洗脱，TFA易挥发、紫外背景吸收小，可减少分析干扰。考虑到配制磷酸盐缓冲液调节pH值较为繁琐，磷酸盐易析出盐分造成系统堵塞等原因，本研究选择乙腈/TFA溶液作为流动相。

324流动相淋洗方式的选择流动相采用等度淋洗时能较好分离较早出峰的MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR组分，但较晚出峰的MCWR、MCLA、MCLY、MCLW、MCLF却很难分开。实际水样中可能存在色素等大分子及其它杂质，这些物质的出峰时间与溶剂和目标物的出峰时间可能接近，会影响目标物的分析。本研究考察了流动相不同初始比例（即005%TFA溶液与乙腈的比例）对10种蓝藻毒素分离效果的影响。发现不同初始比例对较早出峰的MCRR、NOD、MCYR、MCHtyR、MCLR等组分影响较大，特别是MCYR和MCHtyR的分离有更大影响。提高005%TFA溶液的比例对较早出峰的上述物质分离有利， 005%TFA溶液与乙腈的体积比达到69∶31时，上述物质分离良好，其中MCYR和MCHtyR可完全分离，因此流动相选用005%TFA乙腈（69∶31，V/V），其它梯度淋洗优化后的条件详见22节。结果表明，当采用梯度洗脱淋洗时，各组分在35 min内实现良好分离，分离度满足相关要求，色谱峰对称且基线平稳。梯度淋洗使目标物的出峰时间延后，能避免实际样品中大分子物质和其它杂质对蓝藻毒素测定的干扰。

325流动相酸度的选择向流动相中加入一定量的酸，有助于提高各组分的分离效果[25]。本研究向水相中加入不同体积分数的TFA（001%、 002%、 005%、 008%、 010%），考察其对10种蓝藻毒素的分离情况影响。结果表明，10种蓝藻毒素的保留时间随TFA体积分数的增加而推迟，峰面积随TFA体积分数的而变化情况如图1所示，MCWR、MCLF、MCLA、MCLY、MCLW的变化较明显，峰面积随TFA体积分数增加而增加，当TFA体积分数达到005%后趋于稳定；MCLR在很小范围内波动；NOD、MCRR、MCHtyR、MCYR变化不明显。综合考虑，最终选择005%TFA溶液作为水相流动相。endprint

326流动相流速的选择分别考察了流动相流速为06、07、08、09和10 mL/min时分离效果。结果表明，随着流速增大，峰面积降低，峰宽变窄，保留时间缩短，分离效果变好，综合考虑峰面积、保留时间和分离度等因素，最终流动相流速选择08 mL/min。在上述优化的色谱条件下，10种蓝藻毒素的标准色谱图见图2。

33标准曲线与检出限

以质量浓度（x，mg/L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到10种蓝藻毒素的线性方程及其相关系数，见表1。结果表明，在005～200 mg/L浓度范围内，10种蓝藻毒素的线性关系较好，相关系数（R）为09998～09999，完全满足定量分析的要求。

在不含目标化合物的空白水样中进行低浓度加标实验，按照上述方法进行前处理和进样分析，以3倍信噪比计算得到本方法中10种蓝藻毒素的检出限为0005～0020 μg/L，定量限为0016～0066 μg/L（表1）。我国地表水环境质量标准（GB38382002）[20]中仅规定了MCLR的限值为10 μg/L，对其它蓝藻毒素未做限值规定，本实验对MCLR的检出限为0020 μg/L，低于我国地表水环境质量标准中MCLR限值10 μg/L近两个数量级，说明本方法具有很高的灵敏度。

34回收率和精密度

选用不含10种待测组分的湖水样品，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，配成01、10和18 mg/L的加标水样，按照上述方法进行前处理，每个加标水平平行测定6次，加标回收率为851%～1053%，相对标准偏差为08%～92%（见表2），说明本方法有较高的准确度和精密度，适合实际样品10种蓝藻毒素的检测分析。

35湖水样品分析

利用本方法测定华东某湖泊湖区4个不同点位表层水样，测定结果见表3。该湖区采集的样品中检测到微量的MCLR、MCLF、MCRR、NOD等种类蓝藻毒素，其中2个样品检出的MCLF浓度分别为0024和0091 μg/L，检出的MCLR浓度分别为0260和0066 μg/L，低于世界卫生组织[19]和我国地表水环境质量标准[20]中规定的限值。另有1个样品检出的MCRR和NOD浓度分别为0052和0040 μg/L，均处于较低浓度水平。

4结 论

本研究建立了固相萃取高效液相色谱二极管阵列检测器法同时测定湖水中10种蓝藻毒素的方法。利用二极管阵列检测器全扫描光谱定性和色谱峰纯度分析等多重定性方法，很大程度解决了结果假阳性问题，定性更可靠。该方法操作简单、灵敏度高、快速方便，具有良好的精密度、准确度，可作为常规检测和应急检测方法用于地表水中10种蓝藻毒素的检测，对于液相色谱测定蓝藻毒素技术的推广应用具有重要参考价值，也为基质相对复杂的样品中痕量蓝藻毒素的测定提供了较为可靠的方法。

References

1Duy T N， Lam P K， Shaw G R， Connell D W Rev Environ Contam Toxicol， 2000， 163： 113-186

2Xu C， Chen J A， Huang Y J， Qiu Z Q， Luo J H， Zeng H， Zhao Q， Cao J， Shu W Q Environ Monit Assess， 2011， 180（14）： 77-86

3Gurbuz F， Uzunmehmetoglu O Y， Diler ， Metcalf J S， Codd G A Sci Total Environ， 2016， 562： 860-868

4KyoungHee O， DongHwan J， YoungCheol C J Microbiol， 2013， 51（1）： 18-24

5WANG Yang， LI Yue， FENG Yue， ZHANG AMei， XIA XueShan， LIU Li Chinese Journal of Ecology， 2017， 36（2）： 517-523

汪 洋， 李 樾， 馮 悦， 张阿梅， 夏雪山， 刘 丽 生态学杂志， 2017， 36（2）： 517-523

6Chrapusta E， Wegrzyn M， Zabaglo K， Kaminski A， Adamski M， Wietrzyk P， Bialczyk J Toxicon， 2015， 101： 35-40

7Beltrán E， Ibez M， Sancho J V， Hernández F J Chromatogr A， 2012， 1266 （10）： 61-68

8Yan S W， Jia A， Merel S， Snyder S A， O′Shea K E， Dionysiou D D， Song W H Environ Sci Technol， 2016， 50 （3）： 1437-1446

9LI Ting， ZHU WeiPing， LIU ChunHui China Measurement & Test， 2015， 41（2）： 42-45

李 婷， 朱卫平， 柳春晖 中国测试， 2015， 41（2）： 42-45

10LAN JiRong， YANG AnPing， WU LaiYan， WANG SongBo， JIANG JuanJuan， WANG XueWu Journal of Instrumental Analysis， 2015， 34（6）： 664-669

蓝际荣， 杨安平， 吴来燕， 王松波， 蒋娟娟， 王学武 分析测试学报， 2015， 34（6）： 664-669endprint

11Li W， Chen J， Xie P， He J， Guo X C， Tuo X， Zhang W， Wu L Y Aquat Toxicol， 2014， 147： 18-25

12Srivastava A， Singh S， Ahn C Y， Oh H M， Asthana R K Environ Sci Technol， 2013， 47（16）： 8999-9013

13LIU Yang， HU PeiRu， MA SiSan， YE JinYun J Lake Sci， 2016， 28（2）： 246-252

刘 洋， 胡佩茹， 马思三， 叶金云 湖泊科学， 2016， 28（2）： 246-252

14ZHANG Ming， TANG FangLiang， XU JianFen， CHEN Feng， YU Bo， WANG XiaoDong， YAO JianLiang Environmental Chemistry， 2013， 32（6）： 1096-1097

张 明， 唐访良， 徐建芬， 陈 峰， 余 波， 汪晓东， 姚建良 环境化学， 2013， 32（6）： 1096-1097

15Li Y W， Zhan X J， Xiang L， Deng Z S， Huang B H， Wen H F， Sun T F， Cai Q Y， Li H， Mo C H J Agric Food Chem， 2014， 62（49）： 11831-11839

16WANG YanLong， CHEN JunHui， GAO LiYuan， WANG Shuai， ZHENG XiaoLing， SUN ChengJun， WANG XiaoRu Chinese J Anal Chem， 2016， 44（3）： 335-341

王艳龙， 陈军辉， 高莉媛， 王 帅， 郑晓玲， 孙承君， 王小如 分析化学， 2016， 44（3）： 335-341

17Balest L， Murgolo S， Sciancalepore L， Montemurro P， Abis P P， Pastore C， Mascolo G Anal Bioanal Chem， 2016， 408（15）： 4063-4071

18Edwards C， Lawton L A J Chromatogr A， 2010， 1217（32）： 5233-5238

19World Health Organization， WHO Guidelines for Drinking Water Quality 4thed， Translated by both Shanghai Municipal Water Supply Controlling and Monitoring Center and Shanghai Jiao Tong University， Shanghai： Shanghai Jiao Tong University Press， 2014： 263-377

世界卫生组织饮用水水质准则（第四版） 上海市供水调度监测中心， 上海交通大学译 上海： 上海交通大学出版社， 2014： 263-377

20GB 38382002， Environmental Quality Standards for Surface Water National Standards of the People′s Republic of China

地表水环境质量标准 中华人民共和国国家标准GB 38382002

21LIAN LiLi， GUO TingXiu， WU YuQing， JIN Li， LOU DaWei， SUN DaZhi Chinese J Anal Chem， 2015， 43（12）： 1876-1881

连丽丽， 郭亭秀， 吴玉清， 金 丽， 娄大伟， 孙大志 分析化学， 2015， 43（12）： 1876-1881

22ZHAO QiYue， ZHAO HongShuai， LIU BaoXian， LUO Fang Chinese J Anal Chem， 2015， 43（4）： 594-598

赵起越， 赵红帅， 刘保献， 骆 昉 分析化学， 2015， 43（4）： 594-598

23XU Hui， JIANG Min， WANG Jing Journal of Instrumental Analysis， 2015， 34（9）： 1072-1076

许 慧， 江 敏， 王 婧 分析测试学报， 2015， 34（9）： 1072-1076

24ZHANG LiJiang， YIN LiHong， PU YuePu， ZHU GuangCan， LI XianNing， LYU XiWu， Journal of Southeast University（Natural Science Edition）， 2005， 35（3）： 446-451

張立将， 尹立红， 浦跃朴， 朱光灿， 李先宁， 吕锡武 东南大学学报（自然科学版）， 2005， 35（3）： 446-451

25MAO JingYing， YANG Min， DI YiAn， CAO JinLing， REN LiJun， XU QiGong， XI BeiDou Chinese Journal of Environmental Engineering， 2012， 6（11）： 3882-3888endprint

毛敬英， 楊 敏， 狄一安， 曹金玲， 任立军， 许其功， 席北斗 环境工程学报， 2012， 6（11）： 3882-3888

AbstractA method has been developed by solid phase extractionhigh performance liquid chromatography coupled with photodiode array detector for simultaneous determination of 10 kinds of cyanotoxins in lake water， including microcystinRR （MCRR）， MCYR， MCHtyR， MCLR， MCWR， MCLA， MCLY， MCLW， MCLF and nodularin （NOD） The samples were enriched and purified by a HLB solid phase extraction column The separation was performed on a Waters C18 column （250 mm×46 mm， 5 μm） with the gradient elution of acetonitrile and water containing 005% trifluoroacetic acid The flow rate of the mobile phase was 08 mL/min The column temperature was 30℃ and the injection volume was 20 μL The photodiode array detector was scanned from 190 nm to 300 nm and the detection wavelength was 238 nm Multiple qualitative analyses were completed according to retention time， full scanning spectrum of photodiode array detector and purity analysis of chromatographic peak Good linearity was observed in the cyanotoxin concentration range of 005 mg/L-20 mg/L with correlation coefficients （R） from 09998 to 09999 The limits of detection for 10 cyanotoxins were in the range of 0005 μg/L-0020 μg/L The recoveries were in the range of 851%-1053% at the three spiked levels of 01 mg/L， 10 mg/L and 18 mg/L with the relative standard deviations （RSD） of 08%-92% The method was characterized by wide applicability， convenient operation， quick analytical rate， high sensitivity， good accuracy and high recovery The qualitative accuracy was improved by using multiple qualitative analyses This method was successfully applied to determination of 10 kinds of cyanotoxins in lake water

KeywordsHigh performance liquid chromatography； Photodiode array detector； Solid phase extraction； Cyanotoxins； Waterendprint