马哲龙 吴增艳 蒋福升 丁志山

[摘要] 目的 评估塘栖产不同品种枇杷叶的药材品质。 方法 参照2015版《中国药典》，采用烘干法、灼烧法、热浸法分析测定塘栖产不同品种枇杷叶的水分、总灰分和浸出物含量；采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵（67∶12∶21，v/v/v）为流动相，柱温25℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，对齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定。采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，v/v）为流动相，柱温30℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，对槲皮素和山奈酚的含量进行测定。结果 塘栖产各品种枇杷叶水分、总灰分、浸出物含量范围分别为7.87%～9.45%、5.14%～6.22%、25.41%～29.68%；齐墩果酸和熊果酸的含量总和范围为1.04%～1.25%，均符合2015版《中国药典》的标准；此外，枇杷叶中的槲皮素和山奈酚的总含量范围为0.17%～0.29%。 结论 塘栖产地的不同品种枇杷叶均具有较好的品质，值得进一步开发利用。

[关键词] 枇杷叶；齐墩果酸；熊果酸；总黄酮

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0111-04

[Abstract] Objective To evaluate the quality of different varieties of loquat leaves from Tangxi. Methods Reference to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia， the water content， total ash content and extract content of different varieties of loquat leaves were measured by oven drying method， ignition method and hot-dip method. The oleanolic acid and ursolic acid were detected useing Kromasil C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column， with mobile phase being acetonitrile-methanol-0.5% ammonium acetate （67∶12∶21， v/v/v）， column temperature being at 25℃， flow velocity being 1.0 mL/min， and detection wavelength being at 210 nm. The quercetin and kaempferol were detected by Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column， with mobile phase being methanol-0.4% phosphoric acid （50∶50， v/v）， column temperature being at 30℃， flow velocity being 1.0 mL/min， and detection wavelength being at 360 nm. Results The range of water content， total ash content， and extract content of different varieties of loquat leaves were 7.87%-9.45%， 5.14%-6.22% and 25.41%-29.68%， respectively， the range of total content of oleanolic acid and ursolic acid was 1.04%-1.25%， all in line with the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia. In addition， the range of total content of quercetin and kaempferol in loquat leaves was 0.17%-0.29%. Conclusion The different varieties of loquat leaves in Tangxi all have good quality and deserve further development and utilization.

[Key words] Loquat leaf； Oleanolic acid； Ursolic acid； Total flavonoid

枇杷葉是一味临床常用传统中药，来源于蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥叶片，收载于历版《中国药典》[1]中，性微寒，味苦辛，归肺、胃经，具有清肺止咳、降逆止呕等功效，是目前中医常用药，临床使用量大。现代药理研究表明，枇杷叶中的化学成分结构多样，主要有三萜酸类、黄酮类、倍半萜、多酚类、糖苷类以及挥发油类化合物[2-7]。近年来研究表明枇杷叶除具有较好的抗炎和止咳作用外，还具有其他广泛的药理作用，如降血糖、抗肿瘤、抗病毒、保肝和抗氧化等[2，8-17]。通过对枇杷叶化学成分和药理作用的研究，可以看出枇杷叶这一传统中药具有多方面的用途，可用于多种疾病的预防和治疗，并取得了良好的疗效。

我国枇杷资源丰富，主要分布于浙江、江西、广东、福建、台湾、四川、贵州、云南、陕西、甘肃、江苏、安徽等地。其中杭州市余杭区塘栖镇是全国著名的枇杷产区之一，枇杷栽种历史悠久，有“中国枇杷之乡”的美誉。检索文献发现，虽然关于枇杷叶的相关研究报道很多，但目前还没有关于塘栖枇杷叶品质的文献报道，对塘栖这一主要枇杷产地枇杷叶系统研究尚未进行过，这与其果实品质不相称。本研究对塘栖产不同种源枇杷叶的水分、总灰分、浸出物、齐墩果酸、熊果酸和总黄酮含量进行了分析测定，旨在为塘栖枇杷叶资源利用提供科学依据。现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex高效液相色谱仪（美国戴安公司）；Kromasil C18色谱柱（瑞典阿克苏诺贝尔公司，4.6 mm×250 mm，5 μm）；AR2130精密电子天平（Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA，萬分之一）；KQ-3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率50 kHz，）。

1.2 试剂

色谱级甲醇（临海市浙东特种试剂厂，批号：150519）；色谱级乙腈（临海市浙东特种试剂厂，批号：151029）；甲醇（杭州高晶精细化工有限公司，批号：20160122）；双蒸水；枇杷叶对照品（安徽省万生中药饮片有限公司，批号：150501）；齐墩果酸对照品（批号：110709-200505）、熊果酸对照品（批号：110742-200516）、槲皮素对照品（批号：100081-200907）、山奈酚对照品（批号：110861-201209）均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 样品

塘栖产硬条白砂、软条白砂、宝珠、大叶杨墩和平头大红袍5个品种的枇杷叶，均于2016年6月采摘于塘栖镇，经浙江中医药大学丁志山教授鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的树叶。

2 方法与结果

2.1 一般分析

精密称取塘栖枇杷叶各样品及对照品枇杷叶粉末3 g，采用烘干法[1]测定水分含量，热浸法[1]测定浸出物含量，每份样品重复3次；精密称取塘栖枇杷叶各样品及对照品枇杷叶粉末2.5 g，采用灼烧法[1]测定总灰分含量，每份样品重复3次。

2.2 齐墩果酸和熊果酸含量测定

2.2.1 色谱条件 流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21，v/v/v）；检测波长为210 nm，流速1 mL/min，柱温25℃。理论板数按熊果酸峰计算应不低于5000[1，15]。

2.2.2 对照品溶液制备 取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含齐墩果酸48 μg、熊果酸0.21 mg的混合溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液制备 分别精密称取不同品种的塘栖枇杷叶样品及对照品枇杷叶粗粉约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，加乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

2.2.4 样品测定 将已经制备好的对照品溶液和供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，用外标法计算齐墩果酸和熊果酸的含量。

2.3 黄酮类物质含量测定

2.3.1 色谱条件 流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，v/v），检测波长为360 nm，流速1 mL/min，柱温30℃[18]。槲皮素和山奈酚分离结果见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素、山奈酚对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含槲皮素14.4 μg、山萘酚14.2 μg的混合溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取枇杷叶药材粗粉约1 g，精密称定，置具塞平底烧瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4∶1，v/v）50 mL，密塞，称定重量，置水浴中回流1 h，立即冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用。

2.3.4 线性关系考察 取“2.3.2”项制备的对照品溶液1 mL，分别精密吸取5、10、15、20、25、30 μL，注入液相色谱仪，依法测定。以峰面积（y）为纵坐标，进样量（x）为横坐标，求得槲皮素回归方程为：y = 26.303x - 0.0789（R2 = 0.9996），山奈酚标准方程为y = 29.021x + 0.3549（R2 = 0.9995），结果表明槲皮素进样量在0.072～0.432 μg范围内、山萘酚进样量在0.071～0.426 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。见图2。

2.3.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入色谱仪，重复进样6次，槲皮素和山萘酚的色谱峰面积的RSD分别为0.12%和0.13%。

2.3.6 稳定性实验 精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液10 μL，注入色谱仪，按0、2、4、8、16、24 h间隔进样，依法测定槲皮素和山萘酚的色谱峰面积，测得槲皮素色谱峰面积的RSD为0.40%，山萘酚色谱峰面积的RSD为0.50%。

2.3.7 重复性实验 取同一样品粉末，按“2.3.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液并依法测定槲皮素和山萘酚的色谱峰面积，求得峰面积RSD分别为0.23%和0.76%，表明本法重现性良好。

2.3.8 加样回收率实验 取硬条白砂枇杷叶药材粗粉约0.5 g，精密称定，共称取6份，置具塞平底烧瓶中，分别精密加入对照品贮备溶液槲皮素（0.72 mg/mL）700 μL，山奈酚（0.71 mg/mL）500 μL，再按“2.3.3”项下的方法制备供试品溶液，并依法测定，记录色谱峰面积，按外标法计算出槲皮素的平均加样回收率为98.95%（RSD = 1.93%，n = 6），山奈酚的平均加样回收率为98.88%（RSD = 1.86%，n = 6）。见表1～2。

2.4 塘栖各品种枇杷叶与对照品枇杷叶中成分含量测定结果

取塘栖枇杷叶各样品及对照品枇杷叶粉末，分别测定其水分、总灰分、浸出物的含量；按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并测定其齐墩果酸和熊果酸的含量；按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并测定其槲皮素和山萘酚的含量。见表3。

3 讨论

本研究参照2015版《中国药典》对塘栖各品种枇杷叶的药材品质进行研究，结果显示塘栖产各品种枇杷叶水分含量在7.87%～9.45%之间，总灰分含量在5.14%～6.22%之间，浸出物含量在25.41%～29.68%之间，均符合2015版《中国药典》中要求的水分不得超过13.0%，总灰分不得高于9.0%，浸出物不得低于18.0%，并且塘栖各品种枇杷叶浸出物含量明显高于对照品枇杷叶的含量。

塘栖产各品种枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量总和在1.04%～1.25%之间，远高于2015版《中国药典》中要求的0.7%。塘栖产软条白砂、宝珠、大叶杨墩三个品种的枇杷叶中齐墩果酸的含量明显高于对照品中的含量，且熊果酸含量也略高于对照品，硬条白砂和平头大红袍两个品种的齐墩果酸和熊果酸的含量总和与对照品相差不大。现代药理学方法研究证明枇杷叶中三萜酸类成分是其抗炎止咳的主要成分[8-10]，齐墩果酸和熊果酸是药典规定的枇杷叶中有效成分的质控指标，枇杷叶中三萜酸含量的多少直接影响其抗炎止咳的药理作用，由于枇杷的种源较多，不同种源的枇杷叶三萜酸含量差异明显，因此在采收时应考虑枇杷种源以保证药材优良品质。

除三萜类物质外，黄酮类化合物也是枇杷叶中的另一类有效物质，有文献报道黄酮类物质具有镇咳祛痰作用[19-21]，因此总黄酮含量的多少也是影响枇杷叶药材品质的重要因素。枇杷叶中的黄酮类物质主要是以槲皮素、山奈酚为苷元的苷类化合物[2，5]，本研究将枇杷叶中的黄酮类化合物进行水解，然后以槲皮素和山奈酚为对照品对枇杷叶中的总黄酮含量进行测定。实验测得塘栖产各品种枇杷叶中总黄酮含量在0.17%～0.29%之间，对照品枇杷叶总黄酮含量为0.09%，塘栖产枇杷叶中总黄酮含量明显高于对照品枇杷叶。

近年来有关枇杷叶的研究表明枇杷叶除具有良好的抗炎和止咳作用外，枇杷叶三萜酸还具有明显的降血糖作用[11]，并具有一定的调节血脂和抗肿瘤作用[2，11]；枇杷叶总黄酮具有很强的抗氧化活性，可以明显减少DPPH自由基转化的作用[17]。因此三萜酸和总黄酮的含量多少直接影响枇杷叶的药用品质的优劣。

我国枇杷种植范围分布较广泛，且品种极为丰富，枇杷叶的品种繁杂也给其药用品质带来重要影响。中药品质的好坏，取决于有效物质含量的多少，本研究测得塘栖枇杷叶中浸出物、齐墩果酸和熊果酸总量明显高于2015版《中国药典》要求。同时本研究还对2015版《中国药典》中未做含量要求的另一类有效物质黄酮类成分进行了含量测定，经测定塘栖各品种枇杷叶中总黄酮含量也较对照品高出很多，提示塘栖枇杷叶的有效物质含量较高，药用品质较好。通过对塘栖枇杷叶的品质进行研究，期望能促进塘栖枇杷叶的开发，利用当地资源，变废为宝，产生良好的社会效益和经济效益。

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（收稿日期：2018-03-28 本文编辑：张瑜杰）