杨久玲，谢 和，杜超峰

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.蓝茅生态农业有限公司，贵州 黔东南 557500)

红茶是市场上的主销茶类，2015年，中国红茶的产量为25.8万吨，较2014年增长了12.95%，其中内销 15.84万吨，占国内茶叶销量的9%，出口2.8万吨，占茶叶总出口量的8.7%[1]。为了满足不同消费者的需求，更好的占有市场，一些厂商开始研发具有独特风味的红茶制品。目前，已经开发出的红茶产品有各种花香型红茶：如金银花香型[2]、橘子花香型[3]、栀子花香型[4]红茶等；果香型红茶：如蓝莓香型[5]红茶；其他香型红茶：如麦香型[6]、香草香型红茶[7]等。酱香是我国传统食品特有的一种香型，在食品、制酱、酿酒等方面都得到了广泛的应用。如在酿酒方面，酱香型白酒茅台酒被誉为国酒；以茅台酒为原料生产的国酒香型卷烟也已上市销售；在风味食品方面，利用芽孢杆菌发酵生产的酱香风味牛肉[8]等获得了成功。因此，本实验主要通过微生物发酵技术将酱香风味与红茶的特有香味有机地结合起来，研制出一种新型的具有酱香风味的红茶。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1发酵菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)E20菌株，由贵州大学生命科学学院微生物实验室提供。

1.1.2主要培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，自来水1000 mL， pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，灭菌30 min。

种子培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自来水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，灭菌30 min。

发酵培养基：黄豆用水浸泡24 h，分装三角瓶(100 g/500 mL)，121℃，0.1 Mpa，灭菌30 min。

1.1.3主要原料及试剂 红茶：产地为贵州都匀。分析纯试剂：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、茚三酮、碱式乙酸铅、浓盐酸、浓硫酸、甲醇、福林酚、碳酸钠、乙酸乙酯、乙醇、碳酸氢钠、草酸。标准品：茶氨酸、茶多酚、咖啡碱。

1.1.4主要仪器与设备 DH 5000 型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、ZWYR-D2403气浴恒温振荡器(上海智成公司)、TG-W型微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、SW-CJ-1FD型净化工作台(上海锦昱科学仪器有限公司)、XFS-280手提式压力蒸汽灭菌锅(浙江新丰医疗器械有限公司)、TY紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1评分标准 以国家标准GB/T-23776-2009《茶叶感官审评方法》[9]、GB/T-14487-1993《茶叶感官审评术语》[10]为依据，对研制的酱香风味红茶感官审评。酱香风味红茶得分主要是由酱香风味红茶香气及滋味决定。

1.2.2发酵菌剂的制备 菌种活化：将E20菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃培养24 h，重复2～3次，活化菌种。

扩大培养：挑取活化好菌种的单菌落接种至50 mL种子培养基，30℃、150 r/min摇床培养24 h，制取菌悬液。

发酵培养：在发酵培养基中接种2 mL菌悬液，程序升温发酵6 d。

1.2.3单因素筛选试验 在浸提时间12 h、发酵提取液添加量为20%、35℃干燥3 d的条件下，探究不同乙醇溶液浓度对酱香风味红茶品质的影响。发酵培养基发酵完成后，加入100 mL浓度分别为0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液。对制得的酱香风味红茶进行感官审评。

在乙醇溶液浓度为0.0104 mol/L、发酵提取液添加量为20%、35℃干燥3 d的条件下，探究不同浸提时间对酱香风味红茶品质的影响。加入乙醇溶液，分别浸提6、12、24 h。4000 r/min离心20 min。对制得的酱香风味红茶进行感官审评。

在浸提时间12 h、乙醇溶液浓度为0.0104 mol/L、35℃干燥3 d的条件下，探究不同发酵提取添加量液对酱香风味红茶品质的影响。往红茶中分别喷施重量体积比分别为10、15、20、25、30%的发酵提取液，充分混匀。对得到的酱香风味红茶进行感官审评。

1.2.4酱香风味红茶生产工艺的优化 以感官审评为标准，在单因素试验的基础上，参考《生物统计附实验设计》[11]，运用SPSS 20.0设计正交表，对酱香风味红茶的生产工艺进行优化，确定最优的生产工艺。

1.2.5酱香风味红茶主要化学成分的测定 根据国家标准测定酱香风味红茶的总游离氨基酸、茶多酚、咖啡碱、茶红素、茶黄素、茶褐素等主要化学成分。游离氨基酸总量：GB/T8314-2013《茶游离氨基酸总量的测定》[12]采用茚三酮比色法；茶多酚：GB/T8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》[13]采用福林酚显色法；咖啡碱：GB/T8312-2013《茶咖啡碱测定》[14]采用紫外分光光度法；茶色素：《茶叶生物化学》[15]采用紫外分光光度法。并对酱香风味红茶主要化学成分含量与对照茶样进行比较。

2 结果

2.1 乙醇溶液浓度

乙醇是良好的有机溶剂，能与水任意比互溶，且能食用，是本研究的最佳溶剂。往发酵完成的培养基中加入浓度分别为0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液提取酱香物质。

图1 乙醇溶液浓度对酱香风味红茶审评得分的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on soy sauce flavor Black Tea review score

图1结果表明，当乙醇溶液为0.0087 mol/L时，制得的酱香风味红茶得分较低，其香气不纯正，杂味在红茶的香味中显得突兀，影响酱香风味红茶的品质。随着乙醇溶液浓度的增加，酱香越浓郁，滋味越醇正，得分越高。且在浓度为0.0113 mol/L时，得分最高，其酱香浓郁，滋味醇厚，杂味最淡。乙醇溶液浓度超过0.0113 mol/L时，红茶香气中的杂味明显增加。可能是因为乙醇溶液浓度为0.0113 mol/L时，呈杂味的物质溶解得较少。

2.2 浸提时间

浸提时间太短，不能将大部分呈酱香的物质提取出来，浸提时间过长，微生物会产生其他异味，导致酱香风味不纯。因此，选择合适的浸提时间尤为重要。将浓度为0.0104 mol/L的乙醇溶液溶液加入到黄豆发酵培养基，分别浸提6、12、24 h。

图2结果显示，浸提6 h时，得分较低，制得的红茶酱香风味不足，滋味淡薄。浸提时间为12 h时，得分较高，有较浓郁的酱香风味，杂味淡，滋味平和。当浸提时间为24 h，感官评分最高，酱香浓郁，滋味较醇和，杂味淡。

2.3 发酵提取液添加量

往茶叶添加发酵提取液的量直接影响呈香的效果，若添加的量过少，茶叶则不能呈酱香或酱香不够浓郁；发酵提取液添加量过多，茶叶除了呈现酱香风味外，还会呈现更多的杂味。往红茶中分别加入10、15、20、25、30%的发酵提取液，充分混合。

图2 浸提时间对酱香风味红茶审评得分的影响Fig.2 Effect of extraction time on soy sauce flavor Black Tea reviewer score

图3 发酵提取液添加量对酱香风味红茶审评得分的影响Fig.3 The fermentation extract effect of the adding quantity of Maotai-flavor Black Tea review score

图3结果显示，发酵提取液的添加量在20%以前，酱香风味红茶的酱香味不足，在添加量为10%时，甚至感受不到明显的酱香味，因此感官评分较低。当发酵提取液的添加量超过20%，茶叶中除了浓郁的酱香味外，还会有豆豉味、酸味等其他杂味，感官评分得分也较低。当添加量为20%时，茶汤有浓郁的酱香风味，其他的杂味较淡，酱香味和红茶的本味能够很好的融合，使得整体滋味更加醇和。因此，当发酵提取液的添加量为20%时，感官评分最高。

2.4 酱香风味红茶生产工艺的优化

在单因素试验的基础上，选用 L9(34)正交表进行实验，所采用的因素和水平见表1。

表1 正交试验因素与水平设计Tab.1 The factors and the levels

优化结果见表2。

表2 酱香风味红茶最佳生产工艺正交试验设计Tab.2 Maotai-flavor of black tea best production process of orthogonal experimental design

表1显示，三个因素为乙醇浓度、浸提时间、发酵提取液添加量；乙醇浓度0.0104、0.0113、0.0122 mol/L，浸提时间6、12、24 h，发酵提取液添加量15、20、25%。

表2中，根据R值的大小可以看出三个因素对酱香风味红茶的影响存在显著性的顺序，A>C>B，即乙醇溶液浓度>发酵提取液添加量>浸提时间。酱香风味红茶生产的最优条件是A2B2C2，乙醇溶液浓度为0.0113 mol/L、浸提时间为12 h、提取液的添加量为20%。

2.5 酱香风味红茶主要化学成分的测定

根据国家标准测定对照茶样、酱香风味红茶、发酵提取液中的总游离氨基酸、茶多酚、咖啡碱、茶红素、茶黄素、茶褐素，并对酱香风味红茶主要化学成分含量与对照茶样进行比较，结果如下。

表3结果显示，对照茶样中内含物含量分别为：总游离氨基酸1.20%、茶多酚12.61%、咖啡碱2.13%、茶红素4.72%、茶黄素0.62%、茶褐素6.97%；酱香风味红茶中内含物含量分别为：总游离氨基酸2.83%、茶多酚12.62%、咖啡碱2.15%、茶红素4.55%、茶黄素0.66%、茶褐素6.92%。运用独立样本T检验对对照茶样及酱香风味红茶的主要化学物质进行比较，表4发现：总游离氨基酸差异显著，茶多酚、咖啡碱、茶红素、茶黄素、茶褐素差异不显著。对发酵提取液的内含物检测发现：总游离氨基酸含量为 8.82 mg/ml，茶多酚、咖啡碱、茶红素、茶黄素、茶褐素再发酵提取液中几乎检测不到。因此，酱香风味红茶中部分游离氨基酸是发酵提取液中加入的，为茶汤的鲜爽滋味提供了物质基础。

表3 主要化学成分含量(%，DW)Tab.3 Contents of main chemical components

表4 酱香风味红茶与对照茶样主要化学成分的独立样本T检验Tab.4 The independent sample T test of main chemical components with Maotai-flavor black tea and comparison of tea sample

注：“**”表示差异极显著。

3 讨 论

本研究以E20菌株为发酵菌种，黄豆为发酵原料，研制酱香风味红茶，具体加工参数是：在100 g发酵培养基中接入2%的E20菌悬液，按程序升温发酵6 d；将0.0113 mol/L的乙醇溶液100 mL加入到黄豆发酵培养基浸提12 h，4000 r/min离心20 min制得提取液；往红茶中加入20%的发酵提取液，混匀；将茶叶置于35℃干燥箱3 d，即制得了酱香风味的红茶制品。对对照茶样及酱香风味红茶的主要化学物质进行比较，两者总游离氨基酸差异显著，茶多酚、咖啡碱、茶红素、茶黄素、茶褐素差异不显著。说明酱香风味红茶中部分游离氨基酸是由发酵提取液提供的。目前，在利用产酱香微生物开发酱香风味食品，主要是将产酱香风味的微生物接种到需要开发的材料上，如将大庆、谢和研发的风味牛肉[9]，就是将产酱香微生物直接接种到牛肉上，使牛肉发酵产生独特的酱香风味。但是有的原料如茶叶，茶叶的内含物如茶多酚类物质具有广谱的抑菌活性，对近百种细菌均有抑制作用[16-17]，且茶叶上营养寡淡，使得产酱香微生物不能在茶叶上正常生长并且产酱香。因此，要使这类原料产生酱香风味，可以通过先制取发酵提取液，然后喷施到原料上得方法来制取酱香风味食品。

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