王畅

结肠癌诊治水平不断提高改善了患者的预后、延长了生存，辅助化疗是其中有效策略之一。参照目前的各种治疗指南以及循证医学证据，对于III期结肠癌患者，根治术后行以氟尿嘧啶为基础的辅助化疗已成为一种标准的治疗模式，而对于II期患者来说要不要进行术后辅助化疗以及采取什么方案进行辅助化疗仍存在较大争议［1-2］。既往研究表明，对于II期结肠癌患者即使术后给予氟尿嘧啶单药的辅助化疗，其5年的绝对生存获益仅提高2～5%［3-5］，但据2015年一项纳入25个高质量研究的Meta分析发现，未接受辅助化疗的II期结肠癌患者5年总生存 （overall survival，OS）甚至高于接受辅助化疗者［81.4%（95% CI：75.4～87.4）vs. 79.3%（95% CI：75.6～83.1）］［6］。III期结肠癌术后仅接受氟尿嘧啶单药辅助化疗，死亡风险可下降10～15%［7］，在此基础上增加奥沙利铂可进一步使死亡风险降低4～6%［8-10］。可见，无论II期还是III期患者，仅部分患者能从辅助化疗中获益，尤其II期患者获益比例更少，同时考虑到化疗还会给患者身体、生活质量、心理、经济等方面造成的损害，因此如何筛选适合的患者进行辅助化疗，以提高有效率，避免过度治疗意义重大。

目前尚无理想的辅助化疗预测指标，主要仍根据TNM分期和临床病理复发转移高危因素来指导治疗，但正如前文所述，这并不能满足精准医学和实现个体化治疗的要求。因此，理想的治疗方案应着眼于肿瘤和宿主的分子生物学特征，并结合患者的临床病理特点综合决定［11］。目前，对肿瘤分子生物学认识的进展，提示肿瘤相关分子标记物可能更好的识别能从辅助化疗中受益的高危群体，其中微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是当前的研究热点之一，与结肠癌预后和疗效预测密切相关，在早期结肠癌辅助治疗及晚期结肠癌免疫治疗方面均有重要的参考价值，也是本文要讨论的主要内容。

一、结肠癌微卫星状态概述

（一）微卫星不稳定性

微卫星（microsatellite，MS）是指DNA基因组中2～6 个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复（short tandem repeat，STR），如（CA）n、（GT）n、（CAG）n等，尤以（CA）n重复序列最为常见［12］；MSI 是指由于基因复制错误引起基因组中重复序列次数的增加或丢失，导致微卫星片段长度发生了缩短或延长，表现为肿瘤组织与其相应非肿瘤组织DNA结构性等位基因大小发生变化。人类细胞DNA 复制过程中可能整合错误的核苷酸，但旋即会被选择性地从新生DNA 链中移除，从而防止子代细胞出现基因突变，这种机理称为错配修复（mismatch repair，MMR）。MMR相关基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）异常导致的MMR蛋白缺乏（MMR deficient，d-MMR），从而不能纠正DNA复制错误，由此产生MSI。因此，MMR蛋白缺乏是MSI的标志之一。MMR基因缺陷与肿瘤发生密切相关的首例证据是1993 年在遗传性非息肉性大肠癌（hereditary nonpolyposis colon cancer，HNPCC） 患者中发现的［13-14］。结直肠癌发生发展的遗传学改变85%是由染色体不稳定驱动的，而15%是由MSI所致，分析MSI的原因一部分是由任意一个MMR基因（MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2）胚系突变所致，而另一部分是由MLH1启动子区高甲基化所致的表观沉默，后者主要见于散发结肠癌。

（二）MS和MMR状态检测

1997年美国国家癌症研究所工作组（National Cancer Institute，NCI）推荐通过检测基因组上的5个微卫星位点（BAT-25，BAT-26，D5S346，D2S123，D17S250）的不稳定性来判断微卫星不稳定性程度。2个或2个以上位点的不稳定定为微卫星高度不 稳 定（microsatellite high instability，MSI-H）；1个位点不稳定定为微卫星低度不稳定（microsatellite low instability，MSI-L）；无位点出现不稳定定为微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）。另外，MSI也可以通过检测以下10个不同的微卫星标记点：4个单核苷酸重复序列（BAT25，BAT26，BAT40和BAT34C4），5个二核苷酸重复序列（ACTC，D5S346，D18S55，D17S250和D10197），一个复杂标记（MYCL），MSI-H为存在30%或以上的标记不稳定，MSI-L为存在30%以下的标记不稳定，MSS则没有存在标记的不稳定。上述两种检测及评价方法［15-17］临床都有应用，以前者多见。亦可通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）是否存在（pMMR-即MMR蛋白表达；dMMR即MMR蛋白缺失）将MS 分为非MSI-H与MSI-H。在美国NCCN结直肠癌指南中也指出：免疫组化（IHC）检测MMR和PCR检测MSI是应用不同方法检测同一个生物学效应事件［18］，在CALGB 89803研究中两者结果一致性高达97.1%［19］。

（三）MSI-H/dMMR结肠癌特点

微卫星状态与结肠癌临床分期密切相关，在II期结直肠癌中，MSI-H/dMMR患者约占20%左右，在III期结直肠癌中约占12%，而在IV期中最少，约4%左右［20］。既往的研究表明与多数MSI-L/MSS/pMMR结肠癌相比，MSI-H/dMMR结肠癌具有独特的临床病理特点：（1）肿瘤原发部位多位于右半结肠；（2）女性多见；（3）分化程度差；（4）粘液性多见；（5）T分期较晚、肿瘤淋巴细胞浸润多见；（6）区域淋巴结转移较少；（7）同时发生BRAF突变较多，约占50%，而KRAS突变较少［21-24］。

二、微卫星状态在结肠癌中的预后作用和辅助化疗疗效预测作用

（一）微卫星状态在结肠癌中的预后作用

2000年Gryfe等使用NCI推荐的MSI定义对607例年龄≤50岁的结直肠癌预后进行分析，发现Ⅰ～Ⅳ期的MSI-H结直肠癌患者对比MSS患者均具有显著的生存优势（HR：0.42，95% CI：0.27～0.67，P＜0.001），且无论肿瘤浸润深度如何，MSI-H者其肿瘤生物学行为具有较低的区域淋巴结转移率（HR：0.33，P＜0.001）和远处器官转移率（HR：0.49，P=0.02）的特点。该研究首次提示MSI是结直肠癌患者的独立预后因素。Popat等［25］进行的纳入7 000余例患者（其中1 277例为MSI-H）共32项临床研究的荟萃分析结果［26］与之相一致，即无论Ⅱ、Ⅲ期还是Ⅳ期结直肠癌，MSI-H的患者死亡风险较MSS低（Ⅱ～Ⅲ期：HR=0.67，95% CI：0.58～0.78；Ⅳ期：HR=0.64，95% CI：0.46～0.89）。

此后人们进行了一系列MS状态与结肠癌预后的相关研究，多数研究结果提示MSI对结肠癌的预后作用与临床分期密切相关。在II期结肠癌中，MSI-H/dMMR是预后良好的标志已被绝大多数研究所证实，基本达成共识；而对于III期结肠癌的预后价值尚存在争议；对于IV期结肠癌，由于MSI-H例数过少，因此相关结果不能说明其是否具有预后价值。Benatti等［27］对Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌患者进行研究（Ⅱ期患者491例，Ⅲ期461例，Ⅰ期126例，Ⅳ期184例），发现Ⅱ、Ⅲ期的MSI-H 结直肠癌预后较MSS者好，而在Ⅰ期（P=0.363）和Ⅳ期（P=0.66）肿瘤则未得出同样的结论；2009年美国ASCO年会公布的PETACC3研究结果也支持无论是II期还是III期根治术后的结肠癌，MSI-H比MSI-L/MSS的患者具有更好的无复发生存（relapse free survival，RFS）和OS，并且这种优势在II患者更为明显［20］；Sinicrope等［28］研究结果也表明，对于II、III期结肠癌，与pMMR相比，dMMR 组降低了5年复发率（22%vs. 33%；P＜0.001），延长了至肿瘤复发时间（P＜0.001），并降低了远处复发率 （12% vs.22%；P＜0.001），多因素分析，dMMR是独立预后良好因素。而以下研究表明微卫星状态仅对II期结肠癌存在预后作用：2011年，发表在JCO的一项有关CALGB 9581 and 89803的研究结果［29］支持dMMR II期结肠癌患者5年DFS优于pMMR患者，OS有相应趋势，但未达到统计学意义，对于III期肠癌，微卫星状态无相关预后作用；2012年，Merokl等［30］研究提示MSI对不同分期的结直肠癌预后意义是不同的，研究纳入613 例行R0切除的患者（其中Ⅰ期患者117例，Ⅱ期291例，Ⅲ期188例，Ⅳ期17例），结果显示，MSI的Ⅱ期结直肠癌患者较MSS患者5年RFS长（P=0.01），而在Ⅲ期患者未得出同样的结论（P=0.686）；近期，一项来自ACCENT数据库纳入7 803例II、III期结直肠癌的pooled分析显示［31］：在II期仅接受手术的患者中，dMMR比pMMR患者至疾病复发时间（time to relapse，TTR）（HR=0.27；95% CI：0.10～0.75；P=0.01） 和 OS（HR=0.27；95% CI：0.10～ 0.74；P=0.01）明显延长，但在III期患者中未观察到该相关性，提示MMR状态仅与II期结直肠癌患者预后相关。

MS状态对结肠癌的预后作用，不仅与临床分期相关，还与肿瘤原发部位相关。N0147研究结果显示［32］：在III期结肠癌中，近端结肠（盲肠、升结肠、横结肠），dMMR较pMMR有更好的DFS（HR：0.71；95% CI：0.53～ 0.94；P=0.018）；但远端结肠（脾区、降结肠和乙状结肠）未见差异，反而可能更差（HR：1.91；95% CI：1.11～3.26；P=0.018）；近端pMMR较远端结肠癌预后更差（adjusted HR：1.27；95% CI：1.08～1.52；P=0.0047）。PETACC-3研究结果显示［22］：右半结肠癌MSI-H发生率是左半的5倍；无论左半还是右半，MSI-H患者有更好的RFS；在右半肠癌中，MSI-H的患者OS好于MSI-L/MSS患者，而左半肠中无上述表现；对于II期左半结肠癌，MSI-H与MSI-L/MSS的RFS相似；而III期右半结肠癌，MSI-H的RFS明显好于MSI-L/MSS患者。

MS状态对结肠癌预后作用的影响与BRAF和KRAS突变的关系。BRAF、KRAS双野生结肠癌的MSI状态与RFS和OS无相关性［22］；KRAS突变与否，与微卫星稳定性对结肠癌的预后无明显相关性；而在CALGB 89803研究［19］中进一步证实：MSI-H/BRAFMT患者中MSI的预后作用被BRAF突变中和，导致与MSS/BRAF WT患者生存时间相同，换言之MSI-H/BRAF WT患者生存更长，MSS/BRAF WT或MSI-H/BRAF MT生存为中等，而MSS/BRAF MT生存最差。

当然，也有少数研究表明MS状态与结肠癌预后不相关，Kim等［33］探讨了微卫星状态对II期结肠癌患者的预后作用，研究结果表明无相关性。分析MSI在结肠癌预后作用结论不统一的主要原因：（1）MSI-H（dMMR）人群所占比重低，所以纳入的研究标本量少，所得证据不充分；（2）用于分析MSI-H（dMMR）状态的组织标本只能来源于部分临床研究亚组的患者，因此存在选择性偏倚；（3）由于用于检测MSI-H的MSI标记不同，其特异性及敏感性亦不同，由此产生MSI假阳性也是削弱MSI-H（dMMR）的预后好的原因之一。

（二）微卫星状态在结肠癌辅助化疗中疗效预测作用

氟尿嘧啶类药物（卡培他滨或5-FU）±奥沙利铂是结肠癌术后辅助化疗的标准方案。近年，针对微卫星状态预测上述化疗药物尤其是单药5-FU有效性的研究逐渐开展，多数研究结果提示dMMR是负性预测因子，但结论尚不统一。

早在 1999年，Carethers等［34］研究了体外dMMR和pMMR结肠癌肿瘤细胞株对5-FU药物的反应。发现dMMR的结肠癌细胞较pMMR结肠癌细胞在5-FU干扰情况下生长加快，提示MMR蛋白缺乏可能是结肠癌肿瘤组织对抗5-FU药物的机制之一，此结果在后续的研究中得到证实［35］。从此许多学者开始研究MSI（MMR蛋白）状态和结直肠癌化疗敏感性的相关性。Ribic等［36］对5个前瞻性随机对照的III期结肠癌辅助化疗临床研究进行荟萃分析，探讨微卫星状态是否是II、III期结肠癌术后单药氟尿嘧啶疗效的预测标记物，结果显示MSI-H的患者不能从单药5-FU的辅助化疗中获益，5年生存率提高5%的患者不到1%；而MSI-L/MSS患者可明显提高生存，死亡风险下降28%，对于II、III期MSI-L/MSS结肠癌患者能够从术后氟尿嘧啶辅助化疗中获益，而MSI-H患者则不能。Jover等［37］的研究结果进一步支持dMMR的II、III期结直肠癌患者不能从氟尿嘧啶的辅助化疗中获益的结论，多因素分析显示，MMR状态是氟尿嘧啶单药术后辅助化疗疗效的独立影响因素。Sargent等［38］的研究结果表明，对于II期dMMR患者，单药5-FU辅助化疗较单纯手术相比，OS 还明显缩短（HR：2.95；95% CI：1.02 ～8.54；P=0.04）；由此说明MMR（或微卫星）状态与结直肠癌术后辅助化疗单药氟尿嘧啶的疗效密切相关，可能是一个负性疗效预测指标。然而，也有研究结果不支持MS状态对5-FU的预测作用。一项纳入14个临床研究的回顾性Meta分析［39］表明5-FU辅助化疗可延长结直肠癌的生存，但不依赖于MSI状态，因此以MSI状态来指导结直肠癌5-FU单药化疗的治疗决策不能使患者生存获益。

对于III期结肠癌术后仅接受5-FU单药辅助化疗，患者生存获益较少，在此基础上联合奥沙利铂可进一步提高疗效。因此有研究针对III期患者进一步探讨了MS状态对奥沙利铂以及伊立替康等药物的辅助化疗疗效预测作用。在NSABP-C07和N0147临床研究中，均观察到奥沙利铂化疗敏感性不受MS/MMR状态的影响，MS/MMR状态对奥沙利铂无疗效预测作用，在氟尿嘧啶基础上增加奥沙利铂所带来的生存获益削弱了微卫星状态所致的预后差异。在PETACC-3和CALGB 89803两项研究中，还进一步探讨了MS/MMR状态对伊立替康的疗效预测作用，两者结果有所不同。PETACC-3研究［22］表明接受以FOLFIRI辅助化疗的III期患者，疗效不受MSI状态影响；而CALGB 89803研究［19］表明dMMR/MSI-H III期结肠癌患者可能提示以IFL（伊立替康联合5-FU）辅助化疗较5-FU辅助化疗更有效。但无论哪个研究，无论微卫星状态如何，在5-FU基础上增加伊立替康未能给患者带来OS的获益，且毒性增加，因此仍不推荐含伊立替康的辅助化疗方案。

三、微卫星状态对结肠癌术后辅助化疗决策的影响

微卫星稳定性状态检测能够为结肠癌患者提供有价值的预后和预测信息，能够对早期结肠癌术后辅助治疗决策的制定有所帮助。鉴于MSI-H/dMMR较好的预后以及对氟尿嘧啶药物的疗效的预测作用，各临床实践指南对结肠癌辅助化疗的推荐上也有相应的考量。

在2017年最新版本的NCCN结直肠临床实践指南中有如下描述［18］：“既往患有直肠癌或结肠癌的所有个体都应进行MMR或MSI检测”、“II期MSI-H患者预后较好，而且不能从5-FU辅助治疗中获益”、“对于II期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的另一个重要信息就是微卫星不稳定性（MSI）”，并且在辅助治疗的临床路径中明确把MS状态作为T3N0M0 II期患者辅助治疗与否的重要参考指标，如果是MSI-H或dMMR，则推荐术后观察，如果是MSI-L/MSS或pMMR且无高危因素，则推荐观察或临床试验或卡培他滨（或5-FU）单药辅助化疗。

在ESMO早期结肠癌诊断、治疗和随访的临床实践指南［40］中指出：“在决定个体患者何时采用辅助治疗时，风险评估特别重要；最近研究了几种新的预测因子，包括微卫星灶的不稳定性（MSI）/错配修复（MMR）等；目前，最有希望的危险因素是染色体18q 的等位基因缺失（预后不良）和MSI/MMR（预后良好）。特别是MSI/MMR，可用于识别II 期患者中复发风险很低且化疗获益可能性很小的一个小亚组（10～15%）。除了这一预后信息，MSI/MMR状态不能用于指导治疗决定，说明用于评估潜在预测价值的数据具有不均一性。在III 期肿瘤中，MSI/MMR状态的作用还不确定：较早的研究中有关5-FU 单用的潜在获益数据和最近分析的结果不一致，而关于奥沙利铂，目前没有确切的数据。因此，如果计划采用奥沙利铂联合治疗，则无需测定MSI/MMR。”

我国的最新版结直肠癌诊疗规范中指出：建议有条件者检测组织标本 MMR 或 MSI，如为dMMR（错配修复缺陷）或MSI-H（ 微卫星不稳定），不推荐氟尿嘧啶类药物的单药辅助化疗。

综合微卫星状态、临床分期、病理高危因素及现有循证医学证据，在结肠癌术后辅助化疗方面，个人观点如下：

（一）MMR影响II期结肠癌辅助化疗决策

1.pT3N0M0：首先要看是否存在临床病理高危因素，即组织分化程度差（合并MSI-H/dMMR除外）；脉管、神经有浸润；术前合并梗阻、穿孔；淋巴结检出数小于12枚；切缘阳性或不确定，如果有高危因素，建议辅助化疗，并且应用含奥沙利铂联合方案，以避免可能的dMMR对5-FU的耐药。目前针对临床高危II期结肠癌患者行辅助化疗，尚无确切的直接的循证医学证据支持，如需进一步研究、个体化实施。

2.pT3N0M0：无临床病理高危因素，再看微卫星状态，如MSI-H/dMMR，单纯观察即可；如MSI-L/MSS/pMMR，则给予氟尿嘧啶单药辅助化疗。

3.pT4N0M0：建议应用奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案辅助化疗。

（二）III期结肠癌，是辅助化疗的绝对适应证

奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物是其标准辅助化疗方案，患者难以从单药5-FU辅助化疗中获益，dMMR对决策的影响并不适用于Ⅲ期结肠癌患者。对于不适合使用奥沙利铂（如过敏等因素）的III期患者，考虑到dMMR/MSI-H患者可能会从含伊立替康方案中获益，是否基于MSI状态来选择性应用伊立替康进行辅助化疗，值得进行相关研究，但显然目前尚不能应用到常规的临床实践。

综上，应用微卫星状态的检测结果来指导患者的治疗方案的选择无疑代表了肿瘤个体化治疗又向前迈进了一步。然而，在关于MSI与化疗效果关系问题的研究中一直存在MSI-H样本相对不足导致结果缺乏统计学效力的问题，同时，大多数研究均是基于回顾性分析，故可能存在一定程度的选择偏倚，尚需大量的前瞻性随机对照研究加以证实。因此，我们在临床实践中为患者制定治疗决策时，必须结合患者临床病理特征、分子生物学特征以及治疗意愿、经济条件等因素综合考虑、个体化实施。同时也希望发现更多的有价值的分子生物学标记物联合应用，富集适合治疗的人群，真正实现高效低毒的治疗原则，使患者获益。

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