徐革锋 牟振波 陈怀发 黄天晴 王炳谦 谷 伟户 国 韩 英①

(1. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 哈尔滨 150070; 2. 西藏自治区农牧科学院水产科学研究所 拉萨 850032;3. 黑龙江省水生动物资源增殖保护站 哈尔滨 150018; 4. 东北农业大学动物科技学院水产系 哈尔滨 150030)

雌雄异体鱼类的性别决定是由基因(遗传)、环境或是两者共同作用驱动(Devlin et al, 2002; Volff et al,2007; Penman et al, 2008)。在绝大多数哺乳动物中,雄性都是通过Y染色体遗传的。Sry是第一个在哺乳动物 Y染色体上发现的基因, 已被证明是精巢分化与发育的必要条件(Koopman et al, 1990; Sinclair et al,1990), 在该基因被确定为主要性别决定基因的同时,也发现其他基因参与了性别分化的级联调节(Brennan et al, 2004), 但Sry基因在其他物种的性别决定机制中尚未被发现(Capel, 2000; Graves, 2002),这表明性别决定机制在不同种类脊椎动物间不具有明显的进化保守性。与性别决定相反, 决定鱼类性别分化的相关基因和基因网络显示出高度的保守性,即使是不同种类(Munger et al, 2009; Herpin et al,2011; Piferrer, 2011)。与其他脊椎动物一样, 鱼类性腺有两大功能, 即配子发生和类固醇激素合成, 性腺主要的合成产物是性甾体, 雄性激素包括睾酮(T)、11B-羟雄烯二酮和 11-酮基睾酮, 雌性激素主要是雌二醇(E2)。雄性激素和雌性激素分别与雄性和雌性的性腺分化有关。但雌激素主要是性分化和保持雌性特征的必要条件, 而雄激素目前认为是雄性分化的结果(Piferrer et al, 2012)。值得注意的是, 很多基因在两性性腺分化中都存在, 只是表达程度不同。另外, 统计近些年的研究成果可知, 鱼类性腺分化期大部分调控因子主要可以归为以下几类: 类固醇生成酶、性类固醇激素受体、转录因子和生长因子, 但随着研究的深入还发现其他因子存在(Penman et al, 2008)。这些基因中, 类固醇性腺芳香化酶(Cyp19a1a)和转录因子Foxl2占据显著地位。芳香化酶可催化雄激素转化为雌激素, 该生理过程不可逆, 由此确保两种激素的平衡。目前研究认为, 大部分非哺乳脊椎动物的雌性分化依赖 Cyp19a1a定向诱导, 该反应通过一个正反馈回路实现, 主要调控基因为转录因子 Foxl2; 而在雄性分化中 Cyp19a1a的表达会被抑制(Guiguen et al,2010)。Wang 等(2010)的研究认为, 抑制 Cyp19a1a是通过增加Dmrt1实现的; 而转录因子在鱼类种群间相对保守, 是 Cyp19a1a的调节器。大多遗传型性别决定种类脊椎动物具有单一性别决定机制, 而Dmrt1的增量调节主要通过以下这个途径实现: 包括一个雄性主要决定基因或一个联合基因 Sox9, 或者在多因子机制中通过几种雄性促进基因的叠加效应来实现(Piferrer et al, 2012)。

雄性虹鳟的三倍体(Lincoln et al, 1984; 韩英等,2010a)与二倍体性腺有相同的功能和形态, 然而, 雌性三倍体虹鳟是一个例外, 尽管它们能够存活, 但它们卵巢滞育。与二倍体卵巢相比, 三倍体虹鳟卵巢呈线状, 并且缺少相应数量的初级卵母细胞(Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。这说明三倍体虹鳟卵巢与精巢的发育存在着本质区别。早期研究认为, 由于第三套染色体在配子形成过程中扰乱了初始减数分裂, 阻滞了卵原细胞的发育, 因此导致了三倍体虹鳟卵巢发育停滞(Krisfalusi et al, 1999)。韩英等(2010b)的研究还发现, 在 17月龄左右时三倍体雌性虹鳟呈现类雄性化发育趋势(卵巢出现了去分化、再分化的异常现象), 但该特殊现象与普遍认为的鱼类在性腺分化后, 其生殖细胞已失去了性别可塑性的观点相悖。因此, 认为是三倍体虹鳟的卵原细胞胞囊化扰乱了雌性生殖细胞与其体细胞之间的互作, 导致滤泡细胞发育及其性类固醇激素合成通路受阻, 进而中断了睾酮转变为雌二醇的芳香化途径, 最终由于雌激素的缺失开启了卵巢转向雄性化的调控通路。然而, 对于三倍体虹鳟卵巢滞育的这种生理学解释仍无法令人满意, 尤其在三倍体虹鳟卵巢分化及滞育过程中, 雌性化通路的性腺特异基因与性类固醇激素间的联合调控机制, 以及相关基因的级联调控模式是怎么样的, 到目前为止仍不得而知。目前, 一些与性别决定和分化相关的基因已经在虹鳟中被鉴定出来, 包括 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9等(Marchand et al, 2000; Vizziano et al, 2007, 2008a,b; Orrego et al, 2010)。尽管Xu等(2016)初步报道了不同发育阶段三倍体雌性虹鳟的上述基因的级联调控关系, 但对于其卵巢分化及早期滞育的调控机制尚未进行报道。我们检测了卵巢分化及其滞育早期三倍体雌性虹鳟的 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Aox9的相对表达量, 并分析了各基因间的级联调控模式以及在雌性化通路中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和采样

遗传上全雌性三倍体(XXX)虹鳟和正常雌性二倍体(XX)虹鳟从黑龙江水产研究所获得。30dpf(Days post fertilization)发眼卵放置在 10℃水温中,溶解氧为8mg/L, 然后转入到实验设备中即0.3m3的水族箱内, 具有再循环给水系统, 水温 10±0.2℃,恒定光周期(12L︰12D)。在65—68dpf时期, 仔鱼开始集中上浮, 开口摄食后分组(每日饱和投喂商业饵料): 实验组全为雌性三倍体(XXX), 对照组为雌性二倍体(XX), 各试验组均设三个平行组。从上浮仔鱼至4月龄, 每14d采集样本一次, 用于确定性腺分化时间, 每次采集仔鱼30尾, 放于液氮罐内冻存后,–80℃超低温冰箱保存, 用于 RNA提取和 real time RT-PCR分析; 幼鱼期(5—10月龄)每次采集样品 10尾, 分 5尾放于液氮罐内冻存, 用于 RNA提取和real time RT-PCR分析, 5尾分别用Bouin’s固定(用于组织学切片观察)和2.5%戊二醛固定(用于电镜观察),7—10月龄采集血液。

1.2 RNA提取与转录

用TRIzol试剂提取RNA。RNA数量和质量是通过紫外吸光度在260和280nm的Evolution 260 BIO分光光度计(Thermo, 美国)测定。吸光度比值为260/280nm, 超出 1.7—2.1范围的样品将被排除。样品RNA的完整性通过生物分析仪2100专家系统(安捷伦科技公司, 圣克拉拉, 美国)验证, 所有的样本RIN 值都在 8—10。根据制造商的说明, 500ng, 总RNA 30μL反应体系, 使用反向转录核心工具酶(98℃, 10s; 52℃, 30s; 72℃, 1min), 反转录成 cDNA,用10倍的核酸酶自由水将cDNA稀释。

1.3 实时PCR

根据二倍体虹鳟的Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、sox9和Amh序列作为模板, 利用Primer 5.0软件分别设计特异引物(表 1), 检测二倍体虹鳟和雌性三倍体虹鳟性腺组织中基因的表达量情况, 并根据GenBank中二倍体虹鳟的 β-actin基因序列设计内参引物(表1)。实时荧光定量 PCR(ddCt法)结果测定, 用 ABI 7500 Realtime PCR 仪(Applied Biosystems, USA)进行相对定量分析。使用 SYBR®Premix Ex TaqTMII(TaKaRa, Japan)试剂盒, 依照说明书反应为 20μL体系, 包括: SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 10μL; PCR Forward Primer (10μmol/L), 0.4μL; PCR Reverse Primer (10μmol/L), 0.4μL; ROX Reference Dye Ⅱ(50×)×3, 0.4μL; cDNA 模板, 2.0μL; dH2O, 6.8μL。反应程序为95℃ 30s; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40个循环; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 95℃ 15s。每个引物的效率(Baronet al, 2005a, b, c), 由cDNA样本(RNA反转录得到)连续稀释测得, 重复3次。各基因转录水平通过β-actin(内参)的表达量进行评定。将荧光定量PCR检测结果导出, 采用 2–ΔΔCt法计算得到基因定量表达结果(Bogerdet al, 2001)。

表1 实时定量PCR引物序列Tab.1 The nucleotide sequences of the real-time PCR primers

1.4 性激素测定

尾椎静脉采血, 制备血清, –80℃保存待测。根据解剖和切片结果, 对照标记, 选取雌性血样, 采用放射免疫法测定 Estradiol-17β (E2)和 Testosterone (T)含量, 放免试剂盒为北京华英生物技术研究所生产(125I-Na为英国Amersham公司生产, 17β-E2和T抗原及抗体为美国SIGMA公司生产)。

2 结果与分析

2.1 三倍体虹鳟卵巢分化

在 98dpf时期, 三倍体虹鳟已分化出卵巢结构(图1a), 其中具有明显的卵原细胞(图1b, 细胞核: 三角符号)和鞘膜细胞(图1a, 箭头); 卵原细胞胞质中具有大量圆形和带形的线粒体, 偶见高尔基体(图 1c),且细胞核较小, 具有2个核仁。在 84dpf时期, 二倍体虹鳟卵巢分化速度较快, 卵巢中具有大量典型的卵泡结构(图 1d), 卵原细胞大量增殖, 且具有多个核仁(图 1e), 胞质细胞器大量增殖, 高尔基体较为发达(箭头), 线粒体多位长带状(图1f, 三角形)。但随后的发育对三倍体虹鳟卵泡形成和卵细胞增殖均非常不利, 在 154dpf(4月龄), 雌性三倍体虹鳟性腺整体表现为Ⅰ期卵巢结构(图 1g), 卵泡结构明显(图 1h, 箭头), 但卵巢组织间存在大量空隙, 绝大部分区域为无法区分的体细胞组织。在4月龄时期, 二倍体虹鳟卵巢已进入到卵母细胞发育时期(Ⅱ—Ⅲ时期卵巢),细胞核变小(图 1i, 三角形), 核仁清晰(图 1i, 箭头),滤泡层内层为扁平的滤泡细胞(图 1j, 三角形), 外层为鞘膜细胞(图1j, 箭头)。

2.2 三倍体虹鳟滞育期卵巢

图1 二倍体和三倍体虹鳟卵巢分化期结构Fig.1 The gonadal morphology of diploid and triploid female rainbow trout in developmental period

在 5—7月龄时期, 三倍体雌性虹鳟卵巢组织发育停滞(图 2a), 卵细胞始终停留在卵原细胞时期, 且核仁数量较少, 细胞形态不规则, 卵巢组织间隙充满了大量鞘膜细胞。8—9月龄时期, 三倍体虹鳟卵巢结构开始疏松化, 有大面积的空隙出现(图 2b), 超微结构显示, 个别的空隙存有大量微绒毛, 而有些空隙间有膜状物存在(图2c)。10月龄时期, 三倍体虹鳟卵巢发生了退化, 卵巢结构空泡化更加明显, 间质空隙较大(图2d, 箭头)、卵原细胞开始重吸收(图2e, 箭头),胞质内线粒体大量瓦解, 鞘膜细胞不断萎缩(图 2e,三角形), 甚至消失, 卵巢组织进入衰败期, 结缔组织发达, 出现了大量不能区分性质的生殖细胞群。该时期后期, 绝大部分空隙均被微绒毛所占据(图 2f), 卵巢组织内存在庞大的膜系统(图 2g, 三角形), 具有大量深染致密颗粒(图 2g, 箭头), 类似于蛋白物质在性腺外周聚集。在5—10月龄时期, 二倍体虹鳟卵巢具有典型的产卵小板结构, 每个产卵板上分布有数量不等的卵原细胞, 其数量在短时期内大量增殖(图2h),并不断发育成初级卵母细胞和次级卵母细胞(Ⅲ实相卵母细胞)(图2i)。该时期的最主要特征——卵母细胞发育及其滤泡细胞层的形成。

图2 三倍体虹鳟滞育期卵巢形态结构Fig.2 The gonadal morphology of triploid female rainbow trout in development arrest period

2.3 三倍体(XXX)虹鳟卵巢 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9的表达分析

Foxl2和Cyp19a1a在二倍体虹鳟卵巢和精巢中均有表达, 它们在卵巢中表达量均呈逐渐升高趋势,但精巢中的表达量非常低(图3a, 图3b); 这两个基因在雌性三倍体虹鳟性腺中的表达呈先升高后降低趋势, 其表达量均在 8月龄时期达到最大(图 3a,图 3b)。Dmrt1、Amh和Sox9在二倍体精巢和雌性三倍体性腺中的表达均呈不断上调的趋势, 但这些基因在二倍体精巢中的表达量显著高于在雌性三倍体中的表达(图 3c, 图 3d, 图 3e), 这三个基因在二倍体虹鳟卵巢中的表达呈下调趋势(图3c, 图3d,图 3e)。

2.4 三倍体(XXX)虹鳟性类固醇激素(E2和T)的变化趋势

在 10月龄时期, 雌性二倍体与三倍体虹鳟的血液E2差异不显著(P>0.05), 但雄性二倍体血液E2显著低于前两者(P<0.05); 雄性二倍体虹鳟显著高于雌性三倍体虹鳟的血液T含量, 且雌性二倍体虹鳟的血液T含量显著低于前两者(P<0.05)(图4a, 图4b)。

图3 雌性3n体(XXX)虹鳟和2n体(XX, XY)虹鳟不同月龄的基因表达结果Fig.3 The gene expression profiles in gonads of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout

图4 10月龄雌性3n体(XXX)虹鳟和2n体(XX, XY)虹鳟血液E2和T含量对照结果Fig.4 Sex steroid levels of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout at 334dpf

3 讨论

众所周知, 虹鳟的性别分化由性染色体所决定,其自仔鱼首次接受外源性食物之时即开始进入性腺分化时期(Thorgaardet al, 1979; Van Den Hurket al,1981)。但鱼类与哺乳动物的性别决定机制存在极大不同, 而且具有重塑机制, 因为早期大量研究表明,性类固醇激素对于鲑科鱼类性别分化及性腺发育起关键调节作用, 外源性类固醇激素能将性分化期鱼类的遗传性别表型所逆转(Johnstoneet al, 1978;Goetzet al, 1979; Donaldsonet al, 1982; Yamazaki,1983)。本研究发现, 虹鳟的二倍体与三倍体卵巢分化时间前后相差不大, 但分化速度存在差异, 三倍体虹鳟卵巢分化速度较慢, 其卵细胞及其滤泡细胞的数量远远低于二倍体的, 且三倍体的卵细胞及其滤泡细胞形态不规则。尽管三倍体雌性虹鳟能够分化出典型卵巢结构, 但卵原细胞及其滤泡细胞数量有限。早期研究认为, 雌性三倍体虹鳟卵巢分化失常与第三套染色体干扰了初级卵母细胞第一次减数分裂有关(Thorgaard et al, 1979; Chourrout et al, 1986)。显然这个结果无法令人满意, 尽管在三倍体卵巢败育过程中确实发生了生殖细胞与性腺体细胞互作机制失常的情况, 但在该过程性腺特异基因的调控以及与性类固醇激素的协同作用并未被考虑到, 可能基因调控在发生性逆转过程中起到了更为关键作用。

虹鳟即便多出一套染色体也能够生存和繁殖,这一点是其他脊椎动物做不到的, 四倍体(Carrasco et al, 1998)和三倍体(Lincoln et al, 1984; Benfey et al,1986)虹鳟精巢与二倍体虹鳟的有相同功能和形态,然而, 三倍体雌性虹鳟是一个例外, 尽管它们能够存活, 且卵巢可以正常分化, 但幼鱼发育至 5—7月龄时, 三倍体虹鳟卵巢仍停滞在Ⅰ期, 形态呈线状, 颜色透明; 而同时期二倍体卵巢已经发育至Ⅱ—Ⅲ期,卵巢中聚集这大量卵母细胞和滤泡细胞。该时期三倍虹鳟卵巢中缺乏卵母细胞, 鞘膜细胞不断减少, 且形态不规则, 卵巢组织间隙出现大量微绒毛, 个别卵泡开始空泡化。本研究通过大量观察中发现, 从仔鱼上浮开始至5月龄阶段, 三倍体卵巢发育非常缓慢, 几乎维持在分化末期形态, 但卵原细胞及其附属滤泡细胞结构退化严重, 这与Krisfalusi等(1999)关于三倍体雌性虹鳟性腺发育的研究结果相一致。虹鳟三倍体与二倍体卵巢形态相比, 三倍体卵巢呈线状, 并且缺少初级卵母细胞, 这与早期研究结果相一致(Thorgaard et al, 1979; Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。本研究发现, 在4月龄之前, 三倍体雌性虹鳟卵巢就未见清晰可辨认的滤泡细胞层, 这说明卵巢组织只有鞘膜细胞在发挥功能, 由于缺少滤泡细胞, 导致卵细胞与脑垂体性腺轴的联系被切断,因而使得其卵巢始终停滞在早期发育阶段。

有研究报道, 在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) (Ijiri et al, 2008)、虹鳟(Baron et al, 2005a, b,c; Vizziano et al, 2007, 2008b)、鲫(Gobiocypris rarus)(Cao et al, 2012)和大西洋鳕(Gadus morhua) (Haugen et al, 2012)卵巢分化过程中, Cyp19a1a、Foxl2和Bmp4(Baron et al, 2005c; Vizziano et al, 2007)等基因表达量显著上调, 但在诱导雌性虹鳟雄性化过程中这些基因被强烈抑制(Baron et al, 2007, 2008;Vizziano et al, 2008a), 尤其是 Foxl2a, 在鸟类(Hudson et al, 2005)和鱼类(Baron et al, 2004;Nakamoto et al, 2006; Wang et al, 2007)卵巢分化中该基因具有高度保守特征。本研究发现, 在幼年期, 三倍体雌性虹鳟血清雌二醇含量与二倍体雌性的无显著性差异(P>0.05), 但前者同时期Cyp19a1a和Foxl2的表达量显著低于后者, 这可能与卵巢体细胞与卵细胞间的互作关系被切断有关。已有大量研究表明,鱼类的雌激素能够强烈诱导Foxl2表达(Vizziano et al,2007), 而且 FOXL2/Foxl2能够上调 CYP19a/Cyp19a1a的表达(Baron et al, 2004; Wang et al, 2007),因此这两个基因形成了一个正反馈回路。Baron等(2005c)的研究结果很好地证明了上述观点, 即一些雌鱼性腺特异候选基因(如 Foxl2a、Foxl2b和Cyp19a1a等)在雄激素处理时都快速、强烈的被抑制。鱼类雌激素调节Foxl2的表达以及FOXL2/Foxl2正向调节 CYP19/Cyp19a1a, 这强有力的支持了 Foxl2和雌激素之间具有一个短的正反馈回路的假说(Wang et al, 2007; Yamaguchi et al, 2007)。Dmrt1被认为是与硬骨鱼类(Koopman et al, 2003; Raghuveer et al, 2009;Herpin et al, 2011)精巢分化密切相关的基因, 在鱼类性别分化及发育过程中起着重要作用。Vizziano等(2007, 2008a)和 Baron等(2008)的研究表明, 雄性化处理除了早期下调雌性相关特异基因, 还包括诱导精巢支持细胞中Amh、Sox9和Dmrt1等雄性特异基因表达上调。本研究发现, Dmrt1、Amh和Sox9在雌性三倍体虹鳟幼鱼阶段呈逐渐上调趋势, 且随着睾酮含量的增加, 这三个基因的表达显著高于同期在雌性二倍体虹鳟中的表达。在雌性三倍体虹鳟幼鱼早期Amh和Sox9表达量低, 可能与该时期的雌激素和Cyp19a1a对它们的抑制有关。Guan等(2000)和Baron等(2008)在利用雄激素处理雌性虹鳟逆转为雄性的研究中也发现类似结果, 他们认为, 雄激素处理能有效诱导Amh和Sox9持续高表达。在使用外源性雄激素处理雌性虹鳟向雄性转变过程中, 雄激素显著抑制,并下调了 Cyp19a1a的表达, 从而导致了内源性雌激素含量降低, 进而使得性腺向雄性化转变。而在雌性三倍体中, Foxl2和Cyp19a1a表达量下调的诱因不是内源性雌激素含量降低, 而是不断升高的雄激素(睾酮), 并且睾酮显著上调了雄性特异基因表达, 尤其与精巢发育密切相关的基因 Amh和 Sox9。因此, 说明性类固醇激素在雌性三倍体虹鳟性腺过程中可能都扮演着重要角色。

总之, 在所有脊椎动物研究中, CYP19a是一种典型体细胞酶, 且维持着性腺中 Cyp19a1a表达和内源性血清雌二醇合成, 并与体细胞分化状态直接相关。而影响体细胞分化状态的因素可能也依次调控了雌激素合成和卵巢分化结果。在对老鼠卵巢分化的研究发现, 雌激素是维持卵巢体细胞分化的必要条件(Britt et al, 2003)。因此, 维持卵巢分化需要持续高水平的雌激素, 这可能是脊椎动物进化过程中的一个保守特征。可以推断雌性三倍体虹鳟卵巢滞育将导致其体细胞去分化, 这对于 Cyp19a1a表达及雌二醇的合成存在抑制作用。因为这些雌激素是用来维持它们分化和继续发育的, 这可能产生一个负反馈圈, 之后去分化会增强。最近有研究表明, 通过芳香化酶抑制剂(ATD)处理雌鱼, 可使已经分化成雌性的鱼发生雄性化逆转(Nakamura et al, 2003; Bhandari et al, 2006;Ogawa et al, 2008), 这清楚的表明持续高水平雌激素对于维持卵巢分化所起到的决定性作用(或妨碍自生的精巢分化)。

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