肖会敏,雷美娜,何 悦,刘 洋,王四旺

(空军军医大学药学院药物研究所,西安 710032)

清心安神桂仁茶是由酸枣仁、茯苓、莲子、龙眼肉和百合等药食同源中药组成的以清心安神为主要功效的袋泡茶剂。方中酸枣仁含有酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和黄酮类斯皮诺素等成分,其中黄酮类对中枢有抑制作用[1-3]；茯苓具有免疫调节、保肝、抗氧化等作用[4-7]；莲子具有免疫兴奋、抗氧化等功效[8-10]；龙眼具有抗氧化等功效[11-13]；百合对脑内单胺类神经递质的紊乱状态有很好的改善作用[14-16]。本茶剂主要通过粉碎、混匀等工艺制成袋泡茶,为了控制茶剂质量,本研究通过TLC法与HPLC法对清心安神桂仁茶中的有效成分进行定量与定性研究。

1 仪器与试药

1.1仪器 Prominence UFLC型高效液相色谱仪,配LC-20AD双泵,SPD-M20A二极管阵列检测器(日本岛津公司)；KQ5200DE数控超声波发生器(昆山超声仪器有限公司)；BSA124S电子分析天平(德国赛多利斯公司)。

1.2试药 酸枣仁、茯苓和龙眼肉对照药材以及斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B对照品,均购自中国食品药品检定研究院；清心安神桂仁茶(批号：20161208,20161209,20161210),由陕西含光生物科技有限公司研制并提供；甲醇、乙腈均为色谱纯,美国Fisher公司；超纯水,自制；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1斯皮诺素的TLC鉴别 取5袋本品,研细混匀,称取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,加热回流2次,每次2 h,滤过,弃滤液,挥干药渣,加甲醇100 mL加热回流1 h,滤过,蒸干滤液,残渣加2 mL甲醇使溶解,作为供试品溶液；依照处方比例制成缺酸枣仁的茶剂,同法制成酸枣仁阴性对照溶液；取1 g酸枣仁对照药材,同法制成酸枣仁对照药材溶液；另取斯皮诺素对照品,加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的斯皮诺素溶液,作为对照品溶液。依据文献方法[17]进行实验,分别吸取上述不同的4种溶液各5 μL,点于同一硅胶G板上,展开剂为水饱和的正丁醇,展开,取出,晾干,喷质量浓度为10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作为显色剂,于紫外光灯365 nm下检视。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,出现特征斑点,阴性对照无干扰,见图1A。

2.2酸枣仁皂苷A与酸枣仁皂苷B的TLC鉴别 取5袋本品,研细混匀,称取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL加热回流2 h,2次,滤过,弃去石油醚,药渣挥干后加水200 mL,加热回流30 min,滤过,弃滤液,挥干药渣,加甲醇100 mL超声(250 W,100 kHz)1 h,滤过,蒸干滤液,残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液；依照处方比例制成缺酸枣仁的茶剂,同法制成酸枣仁阴性对照溶液；取1 g酸枣仁对照药材,同法制成酸枣仁对照药材溶液；再取酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B加甲醇制成质量浓度均为1 mg·mL-1的混合对照品溶液。依据文献方法[17]实验,分别吸取上述不同的4种溶液各5 μL,点于同一硅胶G板上,展开剂为水饱和的正丁醇,展开,取出,晾干,喷质量浓度为10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作为显色剂,加热至斑点显色清晰。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,出现特征斑点,阴性对照无干扰,见图1B。

2.3茯苓的TLC鉴别 取5袋本品,研细混匀,称取粉末7 g,加100 mL体积分数为80%的乙醇加热回流4 h,滤过,蒸干滤液,再加2 mL甲醇使溶解,作为供试品溶液；依处方比例制成缺茯苓的茶剂,同法制成茯苓阴性对照溶液；另取茯苓对照药材1 g,加20 mL体积分数为80%的乙醇加热回流4 h,滤过,蒸干滤液,加2 mL甲醇制成对照药材溶液。依据文献方法[17]实验,分别吸取上述3种不同的溶液各10 μL,点于同一硅胶G板上,使用展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2),展开,取出,晾干,喷以100 mL·L-1的硫酸乙醇液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,出现特征斑点,阴性对照无干扰,见图1C。

2.4龙眼肉的TLC鉴别 取5袋本品,研细混匀,称取粉末7 g,加乙醇100 mL回流1 h,滤过,蒸干滤液,加水20 mL使残渣溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次20 mL,合并萃取液,用20 mL水洗涤,并将乙酸乙酯层浓缩至2 mL,作为供试品溶液。依照处方比例制成缺龙眼肉的茶剂,同法制成龙眼肉阴性对照溶液；取龙眼肉对照药材1.5 g,按照2.5.3项下方法制成对照药材溶液。依据文献方法[17]实验,分别吸取上述3种不同的溶液各5 μL,点于同一硅胶G板上,使用展开剂为氯仿-甲醇-甲酸(8∶1∶0.25),展开,取出,晾干,在紫外光灯365 nm下检视。结果显示,供试品在与对照药材色谱相应的位置上,出现特征显斑点,阴性对照无干扰,见图1D。

2.5斯皮诺素含量的测定

2.5.1色谱条件及系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A、水为流动相B,0～10 min,B 88%→81%；10～16 min,B 81%→80%；16～22 min,B 80%→40%；22～30 min,B 40%→0%；记录时间：30 min。流速：0.8 mL·min-1；检测波长：335 nm；进样量：20 μL。理论塔板数按照斯皮诺素峰计算应不低于4 000。

2.5.2对照品溶液的制备 取斯皮诺素对照品12.40 mg,置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度,摇匀,即得。

2.5.3供试品溶液的制备 取本品5袋,研细混匀,称取粉末6 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL锥形瓶中,加热回流1 h,去除石油醚,药渣蒸干,残渣加60 mL甲醇,加热回流1 h,滤过,收集并蒸干滤液,加甲醇使残渣溶解,置于5 mL量瓶中,定容即得。

2.5.4酸枣仁阴性对照溶液的制备 按照处方比例及工艺制成缺酸枣仁的茶剂,按照2.5.3项下方法制备酸枣仁阴性对照溶液。

2.5.5标准曲线及线性范围 精密吸取质量浓度为1.24 mg·mL-1的斯皮诺素对照品溶液0.005,0.010,0.030,0.050,0.200和1.000 mL,分别置于2 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,依次得到质量浓度分别为3.10,6.20,18.60,31.00,124.00和620.00 μg·mL-1的系列对照品溶液,用0.45 μm的微孔滤膜滤过,分别吸取各对照品溶液20 μL进样,按照2.5.3项下方法测定峰面积,以峰面积积分值为纵坐标(y)、对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x),绘制标准曲线,得回归方程y=429 563x-236 697,r=0.999 6。结果表明,斯皮诺素质量浓度在3.10～620.00 μg·mL-1范围内线性关系良好。

图1TLC图

A.斯皮诺素:1～2.清心安神桂仁茶；3～4.酸枣仁空白对照；5～6.酸枣仁对照药材；7～8.斯皮诺素对照品。B.酸枣仁皂苷：1～2.清心安神桂仁茶；3.酸枣仁空白对照；4～5.酸枣仁对照药材；6.酸枣仁皂苷A；7.酸枣仁皂苷B。C.茯苓：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.茯苓空白对照；5～6.茯苓对照药材。D.龙眼肉：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.龙眼肉空白对照；5～6.龙眼肉对照药材。

Fig.1 TLC chromatograms

A.spinosin:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；5-6.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；7-8.spinosin standard.B.jujuboside:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；4-5.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；6.jujuboside A;7.jujuboside B.C.Poriacocos:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofPoriacocos；5-6.reference crude herb ofPoriacocos.D.DriedLonganPulp:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofDriedLonganPulp；5-6.reference crude herb ofDriedLonganPulp.

2.5.6专属性实验 取斯皮诺素对照品溶液、供试品溶液和酸枣仁阴性对照溶液各20 μL,按照2.5.1项下色谱条件进样测定。结果见图2,阴性对照无干扰。结果表明,该方法专属性强。

图2HPLC图

A.斯皮诺素对照品；B.样品；C.阴性样品(缺酸枣仁)；1.斯皮诺素。

Fig.5 HPLC chromatograms

A.spinosin reference substance；B.sample；C.negative control (missing spina date seed)；1.spinosin.

2.5.7精密度实验 取斯皮诺素对照品溶液(精密量取质量浓度为1.24 mg·mL-1的线性样品溶液0.030 mL,加甲醇定容至2 mL,即得质量浓度为18.60 μg·mL-1的对照品溶液),连续进样5次,测定峰面积RSD值为1.94%。结果表明,该仪器精密度良好。

2.5.8稳定性实验 取质量浓度为18.60 μg·mL-1的斯皮诺素对照品溶液,在第0,1,2,4,8和12 h进样,测定峰面积RSD值为1.97%。结果表明,12 h内该样品稳定。

2.5.9重复性实验 精密称取样品(批号20161208)5份,按照2.5.3项下方法制备供试品溶液,按照2.5.1项下色谱条件进样测定,结果茶剂中斯皮诺素的含量为88.40 μg·g-1,RSD值为1.90%。

2.5.10回收率实验 取3袋本品(批号20161208),研细混匀,称取粉末6 g(斯皮诺素的含量为88.40 μg·g-1),加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL锥形瓶中,添加对照品溶液,称取斯皮诺素10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,按照2.5.3项下方法制备供试品溶液,按照2.5.1项下色谱条件进样测定,结果见表1。由表1可知,平均加样回收率为96.07%,RSD值为1.39%。结果表明,该方法加样回收率良好。

表1斯皮诺素加样回收率测定结果

Tab.1 Results of the recovery test of spinosin

取样量/g相当于斯皮诺素的量/mg添加斯皮诺素的量/mg测出斯皮诺素总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%2.28910.20240.140.336896.000096.071.392.15240.19030.160.340293.68752.67480.23650.190.421897.52633.19670.28260.230.501495.13043.22600.28520.230.508797.17392.65630.23480.190.418996.8947

2.5.11样品测定 按照2.5.3项下方法进行制备,按照2.5.1项下色谱条件进样测定,按照外标法计算。结果显示,3批样品中斯皮诺素的平均含量为90.60 μg·g-1,RSD值为1.34%。结果表明,不同批次间均一性较好。

3 讨论

3.1TLC鉴别 依据文献方法[18],对茶剂中酸枣仁药材及其中的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和茯苓药材进行鉴别,结果可检出清晰的特征斑点,Rf适中,重复性较好,专属性强,故列入质量标准。依据文献方法[19],对茶剂中的龙眼肉进行鉴别,可检出特征斑点,同时具有重复性与专属性,故列入质量标准。依据文献方法[7],对茶剂中百合、莲子进行鉴别,出现清晰斑点,阴性对照有干扰,无专属性,故未列入质量标准。

3.2含量测定 依据文献方法[18],对制样方法进行筛选,筛选方法1：第一步,用石油醚回流4 h；第二步,①用体积分数为70%的乙醇回流2 h,或②用不同体积分数的甲醇(0,50%,70%和80%)超声30 min或③用不同体积分数的乙醇(50%,70%和80%)超声30 min或④乙腈超声30 min。筛选方法2：水提醇沉法,检测结果均不理想,后采用先用石油醚回流1 h,再用甲醇回流1 h的方法,结果显示,目标峰分离度大于1.5,阴性对照无干扰。经方法学考察,各项指标均符合要求。

综上所述,把具有良好稳定性与重复性的含量测定项及专属性强、重复性好的TLC鉴别(即斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B成分以及茯苓、龙眼肉药材)进行鉴别,纳入质量标准,可以很好地控制茶剂的质量。

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