张梦玥，胡坤，孙榅淑，李怀奇，孙军伟，杨惠娟，王新中，史宏志

(1.河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地，河南 郑州450002；2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016；3.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000)

膜下小苗移栽对烟草成熟期叶片超微结构及品质的影响

张梦玥1，胡坤1，孙榅淑1，李怀奇2，孙军伟3，杨惠娟1，王新中3，史宏志1

(1.河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地，河南 郑州450002；2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016；3.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000)

为了促进云南大理红花大金元烤烟上部叶发育，提高烟叶品质，进行了膜下小苗移栽对成熟期烟叶超微结构和烤后烟叶增质效果试验研究，并对第19生理叶位叶片取样、制片、观察，并对烤后烟叶经济性状、中性致香物质等进行分析。结果表明，小苗移栽处理成熟期烟叶的栅栏组织细胞液泡内及液泡膜上含有的颗粒状高电子密度脂蛋白类物质、嗜锇颗粒、淀粉粒较多，叶绿体、细胞核表现出较成熟状态，且小苗移栽产量和产值较高，化学成分更协调，中性致香成分含量较高，感官质量较好。

烤烟；膜下小苗移栽；超微结构；烟叶品质

烤烟膜下小苗移栽是充分利用光、温、气、水、肥、土等自然资源与地膜覆盖效应，通过使膜下形成温室小气候，提温保墒，从而解决因春季低温和干旱无雨影响大田移栽工作的有效方法，也是促进烟草根系良好发育，提高烟株吸肥控肥能力，使烟株早发快长、早成熟、早采收的有效措施，同时还具有可利用地膜的反光驱蚜与不剪叶的优势，减少病虫害发生，并通过改善土壤温度水分状况，加剧微生物活动，防止土壤板结，提高土壤肥力，增进肥效，提高烤烟经济效益[1-4]。近年来，云南省大理州积极推广烤烟膜下小苗移栽技术，此举促进上部叶的良好发育，有效控制烟草病毒病、大幅降低育苗田间管理成本，提高烟叶产质量。但前人研究仅止步于膜下小苗移栽对预防病毒病，提高烟叶经济性状等方面的影响，对小苗移栽技术要领探讨占大多数[5-6]。有关小苗移栽技术对叶片生长发育过程中细胞结构变化、烤后烟叶香气物质生成、卷烟产品评价方面的影响研究甚少。烟草叶肉细胞及其内部细胞器的发育状况与物质代谢存在密切联系，并直接或间接地影响烟叶最终品质[7]。对此进行深入研究，将更好阐释膜下小苗移栽技术对烟叶发育、烤后叶片以及烟草制品质量提高方面的作用[8]。为此，本研究对膜下小苗移栽方式对成熟期叶片超微结构和烤后烟叶物理性状、化学性状、香气、感官质量等影响进行了分析，为今后推广膜下小苗移栽技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2014—2016年在云南省大理州弥渡县红岩镇西双村进行。供试土壤为重壤土，基本理化性质为pH 6.3，有机质19.3 g·kg-1，全氮2.1 g·kg-1，全磷0.8 g·kg-1，全钾18.6 g·kg-1，有效氮121.91 mg·kg-1，速效磷35.36 mg·kg-1，速效钾152.76 mg·kg-1。设2个处理，膜下小苗移栽(T1)和常规苗膜上移栽(CK)，进行对比试验，重复3次，每个小区200株烟。小苗和常规苗同时播种育苗，于2014-04-15，2015-04-15，2016-04-15移栽小苗，此时小苗有4～5片叶，苗高5～6 cm，移栽后按照规范的小苗移栽技术[9]进行大田管理，及时覆盖黑色地膜，通过在苗穴两侧打孔方式加强通风，待烟苗长大，叶片抵达薄膜时掏苗并及时围根、封膜，之后同常规大田管理。于每年的05-01移栽常规苗，此时常规苗有7～8片叶，苗高10～15 cm，剪叶2～3次，栽后及时覆膜并掏苗。移栽密度均为16 500株·hm-2，氮用量90 kg·hm-2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K20)=l∶l∶3。根据各处理烟叶的成熟度适时采收，采收烟叶使用三段式烘烤工艺[10]进行烘烤，烟叶采烤结束后分别取C3F,B2F烟叶样品，用于测定烟叶物理性状、化学成分、香气物质、感官质量等。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 叶片超微结构的测定 于2016-07-12与2016-07-24取自下向上数第19片生理叶，每个处理3次重复。取样时，将载玻片放于培养皿中的冰块之上。将生长在烟株上的叶片放在载玻片上，用刀片迅速从叶中部主脉附近切下一个长方形叶块(约0．5 cm×1．5 cm)，并置于载玻片上。然后，将培养皿放在一个固定的平面上，并迅速用针管抽取少量戊二醛固定液，滴在叶片样品之上。左、右手各拿着一把刀片，用对拉法从叶片样品上切下一个小叶块(约1 mm×2 mm)，用刀片将小叶块轻轻拨入盛有固定液的小药瓶中。取完所有重复样品后，盖上瓶盖，并迅速用注射器抽吸戊二醛固定瓶中的气体，直到叶片悬浮于固定液中或沉入瓶底，最后放入4 ℃冰箱保存。在用透射电镜观察前，先用1%的锇酸溶液双重固定，再用各级丙酮脱水，Epon 812包埋，LKB超薄切片，经乙酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后，于Hitachi 600透射电镜下观察。每个处理观察3个样本，各样本选取5个清晰的视野，最终选1个有代表性的视野观察并拍照。观测指标为栅栏组织细胞、叶绿体、线粒体、细胞核等超微结构(烟叶细胞超微结构制片与观察均在南京林业大学实验室进行)。

1.2.2 物理性状的测定 依据吉文书等[11-12]的研究方法对烟叶的叶长、叶宽、单叶重、含梗率进行测定。

1.2.3 经济性状测定 各小区挂牌采收烟叶，烤后烟按照国家烤烟42级分级标准进行分级。参照当地烟叶收购价格，记录各处理烟叶的产量、产值、均价、上等烟比例等经济性状。

1.2.4 化学成分测定 烟叶采用AAⅢ型连续流动化学分析仪(德国BRAN+LUEBBE公司生产)测量烟叶中的总糖、还原糖、烟碱、总氮、蛋白质、钾、氯的含量(烟碱：YC/T 160—2002，水溶性糖、还原糖：YC/T 159—2002，氯：YC/T 162—2002，总氮：YC/T 161—2002，钾：YC/T 217—2007)。

1.2.5 中性致香成分测定 前处理采用“水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶液萃取”法，所得样品由GC/MS鉴定结果和NIST库检索定性。采用美国Trace GC ULTRA-DSQ II型气质联用仪对烟叶样品进行定性分析，内标法定量，测定条件及步骤参照姬小明等[13]的方法进行。

1.2.6 感官质量评价 将样品按部位去梗后进行切丝卷制单料烟，于2014年12月、2015年12月、2016年12月由红云红河烟草集团、河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地5位评吸专家分别按风格、香气质、香气量、浓度、杂气、劲头、刺激性、余味、燃烧性、灰色等进行9分制评价。

1.3 统计分析

应用SPSS 20.0软件对中部叶和上部叶的各项数据进行t测验。

2 结果与分析

2.1 膜下小苗移栽对红花大金元成熟期叶片超微结构的影响

图1～图5为膜下小苗移栽与常规苗移栽成熟期第19生理叶位栅栏组织的超微结构比较。由图1A和B可知，两处理叶片栅栏组织中的细胞器均贴细胞壁分布，对照细胞的液泡内及液泡膜上含有很少量颗粒状高电子密度脂蛋白类物质，T1(图1A)细胞液泡内及液泡膜上含有的颗粒状高电子密度脂蛋白类物质比对照略多。由图2A和B可知，两处理叶绿体中的淀粉粒含量均较少，体积也相对较小，图2A的嗜锇颗粒含量略多于图2B。由图3A和B可看出，两处理线粒体均基本正常，但图3A的线粒体较图3B更多。由图4A和B可看出，两处理叶绿体的类囊体片层均较多，排列有序、规则，但图4A处理结构更清晰，且细胞核液异染色质化程度均匀，相比而下，图4B中细胞核表现出幼嫩状态。

图1C和D显示出两处理叶片栅栏组织中的细胞器贴细胞壁分布,在细胞的液泡内及液泡膜上含有的颗粒状高电子密度脂蛋白类物质与图1的A和B相比未见明显增多。由图2D可看出，叶绿体中的淀粉粒含量没有明显增加，只是体积比图2B中略有增大，由图2C可知,叶绿体中的淀粉粒含量与图2A相比明显增多，体积也明显增大，且比图2D中的淀粉粒含量多，体积大。图4中两处理嗜锇颗粒含量和体积没有明显变化。由图5C和D可知，图5D中叶绿体的类囊体片层仍较多，排列有序、规则、并且结构较清晰，线粒体、细胞核也仍基本正常，图3～图5中叶绿体大部分类囊体片层结构较清晰，少部分形状发生改变，线粒体基本正常，细胞核轻微降解。

Chl:叶绿体；V:液泡；N:细胞核；S:淀粉粒；O:嗜锇颗粒。A：07-12 T1第19生理叶位；B：07-12 CK第19生理叶位；C：07-24 T1第19生理叶位；D：07-24 CK第19生理叶位。下同。

Chl: Chloroplast; V: Vacuole; N: Nucleus; S: Starch grain; O: Osmiophilic granules. A：19th physiological leaf of T1 in July 12th; B：19th physiological leaf of CK in July 12th; C：19th physiological leaf of T1 in July 24th; D：19th physiological leaf of CK in July 12th.The same as below.

图1膜下小苗移栽对红花大金元叶片栅栏组织细胞液泡的影响(Bar=10μm)
Fig.1EffectofseedlingtransplantunderplasticmulchingonvacuolesofpalisadetissueofHonghuadajinyuan(Bar=10μm)

图4 膜下小苗移栽对红花大金元叶片栅栏组织的细胞核的影响(Bar=2 μm)Fig.4 Effect of seedling transplant under plastic mulching on nuclear in the chloroplast of palisade tissue of Honghuadajinyuan(Bar=2 μm)

图5 膜下小苗移栽对红花大金元叶片栅栏组织叶绿体中类囊体片层的影响(Bar=500 nm)Fig.5 Effect of seedling transplant under plastic mulching on lamella in the chloroplast of palisade tissue of Honghuadajinyuan(Bar=500 nm)

2.2 膜下小苗移栽对红花大金元植株性状的影响

从烤后烟叶植株性状测定结果(表1)可以看出，无论上部叶，还是中部叶，小苗移栽烟叶叶宽均显著大于常规移栽的烟叶，其中上部叶叶宽较常规移栽提高了14.49%，中部叶提高了25.25%,且上部叶单叶质量也显著高于常规移栽烟叶，提高18.52%，中部叶单叶质量则提高13.45%,但含梗率低于常规移栽的烟叶。由此看出,小苗移栽烟叶长势较好，物理性状得到很大改善。

表1 膜下小苗移栽对红花大金元植株性状的影响Table 1 Effect of seedling transplant under plastic mulching on the physical properties of Honghuadajinyuan

注：表中的数据代表平均值，每部分同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note： The data indicate mean in this table. The different lower cases in the same column in each part indicate significant difference at 0.05%. The same as below.

2.3 膜下小苗移栽对红花大金元经济性状的影响

对烤后烟叶经济性状进行分析可知(表2)，小苗移栽烟叶产量、均价均显著高于常规移栽烟叶，也较常规移栽产值有了显著提高。其中产量比常规移栽提高6.5%，产值增加15.4%，均价比CK提高8.3%，中上等烟比例增加4.3%。

表2 膜下小苗移栽对红花大金元经济性状的影响Table 2 Effect of seedling transplant under plastic mulching on the economic traits of Honghuadajinyuan

2.4 膜下小苗移栽对红花大金元化学成分的影响

小苗移栽和常规移栽烤后烟叶总糖和还原糖含量均较高，且常规移栽烟叶高于小苗移栽。两组烟叶的烟碱和总氮含量均在适宜含量范围内，小苗移栽处理的烟苗的烟碱含量高于常规移栽，尤其在上部叶中更为显著。两组的糖碱比均接近10，小苗移栽的上部叶糖碱比略低于对照。对照中部叶总糖含量显著高于小苗移栽处理的烟叶，而烟碱含量较低，不利于化学成分的协调。两组样品的蛋白质含量均低于10 g·kg-1，且上部叶和中部叶钾含量均显著大于对照组，钾/氯比均较高，燃烧性好。总之，小苗移栽烟叶的常规化学成分协调性较好(表3)。

表3 膜下小苗移栽对红花大金元化学成分的影响Table 3 Effect of seedling transplant under plastic mulching on the chemical components of Honghuadajinyuan g·kg-1

2.5 膜下小苗移栽对红花大金元中性致香物质的影响

烟叶中的香气物质含量和组分与烟气的香味品质密切相关[14-15]。经对烤后烟叶样品测定，共检测出27种对烟叶香气物质有较大影响的化合物。由表4可知，小苗移栽烟叶各类别的香气成分含量均高于对照，其中中部叶的类胡萝卜素类降解产物总量、棕色化反应产物总量、芳香族氨基酸降解产物总量分别比对照增加 27.6%,6.6%和17.4%，上部叶的这3类香气成分分别比对照增加24.2%,2.9%和10.9%。类西柏烷类为腺毛的主要分泌物，对烟叶的香气质量具有重要贡献，小苗移栽处理的中部叶的茄酮含量较对照增加了47.0%，上部叶则增加了27.9%。新植二烯为叶绿素类降解产物，其阈值较大，对烟叶的香气贡献较小，但仍与烟叶香气质量呈正相关[16,17]。小苗移栽处理的中部叶和上部叶的新植二烯含量分别比对照提高了45.2%和28.5%。中部叶和上部叶中,除新植二烯外,香气物质总量也较对照提高了29.6%和20.7%。可见，膜下小苗移栽有利于提高烟叶的香气成分含量。

表4 膜下小苗移栽对红花大金元上部叶中性致香物质的影响Table 4 Effect of seedling transplant under plastic mulching on the contents of neutral aroma components of upper leaves of Honghuadajinyuan μg·g-1

2.6 膜下小苗移栽对红花大金元感官质量的影响

对中部叶的感官质量分析可知，小苗移栽和常规的烟叶均有显著的清香型风格，烟气浓度中等，香气质较好，香气量较足，余味较舒适，燃烧性较强，烟灰较白。与对照相比，小苗移栽处理烟叶的清香型风格更显著，香气质更好，香气量更足，杂气和刺激性稍小，劲头略低于对照，总分比对照略高。

对上部叶的感官质量进行分析可知，小苗移栽处理后的烟叶有显著的清香型风格，对照组的烟叶有较显著的清香型风格。小苗移栽处理的上部叶的香气质显著优于CK，而中上部叶的香气量均显著高于CK，杂气较CK略轻，而该处理中上部叶的劲头均大于CK,上部叶表现更显著，刺激性略比CK小，余味也较舒适。小苗移栽组和对照组的燃烧性均较强，且前者评分更高，烟灰均为白色。总体评分小苗移栽处理优于CK。

表5 膜下小苗移栽对红花大金元感官质量的影响Table 5 Effect of seedling transplant under plastic mulching on the sensory quality of Honghuadajinyuan

3 结论与讨论

嗜锇物质的主要成分是亲脂性的醌类物质，是烟叶香气、油分的重要来源，在烟叶烘烤过程中随着叶绿体的降解而被逐渐转移到烟叶内部或表面，进而对烟叶品质产生影响[18-19]。成熟期小苗移栽处理叶片的栅栏组织细胞中嗜锇物质多于对照，因此产生较多香气物质，评吸结果中香气质、香气量评分较高。叶绿体是绿色植物光合作用的重要细胞器，是有机物合成和积累的重要场所，烟草生长过程中叶绿体的形成、发育与降解与烟叶产质量关系密切[20]。比较对照得出，小苗移栽的烟叶在成熟期类囊体片层结构离散，且小苗移栽使成熟期温度提高，有利于叶绿体中色素、多酚等烟叶致香成分的前体有机物的转化[21]，形成较多类胡萝卜素和叶绿素的降解产物。小苗移栽处理的叶片栅栏组织中合成的淀粉粒较大较多，与烟苗根系活力提高、烟田光照条件的改善有关[4]。 以上现象从细胞学角度证明了膜下小苗移栽可使叶片内含物充实,烟叶的香气物质含量增加，易烤性增强, 因此，烤后叶色多橘黄、金黄,油分足,商品价值高。云南大理烟苗移栽时气温较低，且存在春旱，膜下小苗移栽有利于提高地温、抗旱保墒。加上膜下小苗移栽处理成熟采收较早，避开了常规成熟采收期的低温多雨天气，避免因氮素重吸收使烟叶返青的情况，减少了后期低温对烟叶品质的影响。在云南大理产区，移栽早的烟苗进入旺长期时雨季还没有到来，为使烟株在旺长期有充足的水分供应，该产区烟苗移栽期普遍较晚，使得膜下小苗移栽“早发快长”的优势难以体现。在灌溉设施和条件允许的地区，适当提早移栽期可以使膜下小苗移栽的优势充分发挥。

小苗移栽烟叶成熟期叶片栅栏组织细胞液泡内及液泡膜上含有的颗粒状高电子密度脂蛋白类物质、嗜锇颗粒、淀粉粒含量均多于对照，叶绿体中的少部分类囊体片层出现消融现象，细胞核轻微降解，膜下小苗移栽有利于烟叶的成熟落黄。与对照相比，膜下小苗移栽烟叶物理特性有所改善，产量和产值较高，化学成分协调，中性致香成分含量较高，增质效果明显。

[1] 孔银亮，韩富根，沈铮，等.小苗膜下移栽对烤烟硝酸还原酶、转化酶活性及致香物质的影响[J]. 中国烟草科学, 2011, 32(6): 47-52.

[2] 罗旭，杨志炜. 烟草小苗膜下移栽技术及成效[J]. 现代农业科技, 2014(21): 43.

[3] 李绍志，田建国. 烤烟地膜覆盖膜下小苗膜下移栽栽培技术[J].烟草科技, 1996，26(5):38-39.

[4] 李迪，张林，左学林，等. 烤烟膜下小苗移栽的配套技术及应用效果[J]. 河南农业科学, 1999(10): 37-38.

[5] 孔银亮. 膜下小苗移栽对预防病毒病、烟草生长发育及经济性状的影响[J]. 烟草科技, 2011(9):75-80.

[6] 钱宇，蒋旭，郭群召，等. 高海拔烟区烤烟小苗膜下早栽对烟叶产质量的影响[J]. 中国烟草科学, 2013, 34(5): 18-22.

[7] 时向东，焦枫，叶红朝，等. 黏土和沙壤土对烟叶发育过程中栅栏细胞超微结构的影响[J]. 河南农业大学学报, 2010,44(3):249-254.

[8] 滑夏华，张松涛，李肃，等. 不同生态区烤烟叶片发育超微结构的对比研究[J]. 江西农业学报, 2012, 24(7): 93-96.

[9] 赵兴，宫长荣. 烤烟三段式烘烤及配套技术的推广应用[J].中国烟草科学，1993，14(3):1-5.

[10] 李绍志，田建国. 烤烟地膜覆盖膜下小苗移栽栽培技术[J].烟草科技，1996(5):38-39

[11] 吉文书，腾兆波. 烟草物理检测[M].郑州：河南科学技术出版社，1997.

[12] 邓小华，陈冬林，周冀衡，等. 湖南烤烟物理性状比较及聚类评价[J]. 中国烟草科学，2009，30(3)：63-68.

[13] 姬小明,叶金果,赵铭钦,等. 烤烟水溶性糖类物质含量与中性致香成分含量的关系[J].湖南农业大学学报,2012,38(5):556-561.

[14] 韩锦峰，汪耀富，钱晓刚. 烟草栽培生理[M]. 北京：中国农业出版社，2003: 189-221.

[15] 左天觉．烟草的生产、生理与生物化学[M]. 朱尊权,等译.上海：上海远东出版社，1993: 199-208.

[16] 张勇德，李小勇，赵铭钦，等.不同基因型烤烟生长发育过程中叶片细胞超微结构的比较研究[J].延边大学农学学报,2013,35(3):211-218.

[17] 于建军，庞天河，任晓红等. 烤烟中性致香物质与评吸结果关系研究[J]. 河南农业大学学报，2006，40(4)：346-349.

[18] 史宏志，邸慧慧，赵晓丹，等. 豫中烤烟烟碱和总氮含量与中性香气成分含量的关系[J]. 作物学报，2009，35(7)：1299-1305.

[19] 叶贤文. 会理不同海拔烟叶嗜饿颗粒的分布特征及其与烤烟品质的关系[D]. 郑州:河南农业大学，2009.

[20] 皮本阳，戴林建，方杰，等. 烟草叶绿体结构及发育影响因素的研究进展[J].作物研究，2013,27(2):203-206.

[21] 杨永霞，张嘉炜，贾宏昉，等. 成熟期温度对烟叶质体色素积累及香气成分的影响[J]. 烟草科技，2016，49(5):16-22.

Effectofseedlingtransplantunderplasticmulchingoncellultrastructureatmaturitystageandqualityoftobacco

ZHANG Mengyue1, HU Kun1, SUN Wenshu1, LI Huaiqi2,SUN Junwei3, YANG Huijuan1, WANG Xinzhong3SHI Hongzhi1

(1.National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Henan Tobacco Industry Limited Liability Company,Zhengzhou 450016,China; 3.Dali Tobacco Company of Yunnan Province, Dali, 671000, China)

In order to promote the development and the quality of flue-cured tobacco leaves in Dali of Yunnan, a comparison experiment was conducted to investigate the effect of seedling transplant under plastic mulching on the cell ultrastructure at maturity stage and the quality of tobacco after curing. The 19th physiological leaf was sampled, flaked,and observed, and the economic characters and neutral aroma components of tobacco leaves were analyzed. The results indicated that in the tobacco leaves with the technology of seedling transplant under plastic mulching ,the content of lipoprotein with high electronic density, starch grain and osmiophilic granules in the vacuole and the vacuole membrane of palisade tissue cell increased and the chloroplast and nuclear were degraded slightly at maturity stage. The output value, the chemical compositions, the neutral aroma and the sensory quality were better.

flue-cured tobacco; seedling transplant under plastic mulching; cell ultrastructure; quality of tobacco leaves

2017-04-12

云南省烟草公司科技项目(2013YN28 )

张梦玥(1993-)，女，河南巩义人，硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究。

史宏志(1963-)，男，河南滑县人，教授，博士。

1000-2340(2017)06-0755-08

S 572

A

常思敏)