张瑜，杨健*，赵玉洋，杨光，袁媛*，刘雅萍

(1.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.大连普瑞康生物技术有限公司，辽宁 大连 116200)

·基础研究·

UPLC-MS/MS法测定四种雪莲培养物中九个维生素类成分含量△

张瑜1，杨健1*，赵玉洋1，杨光1，袁媛1*，刘雅萍2

(1.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.大连普瑞康生物技术有限公司，辽宁 大连 116200)

目的建立超高效液相色谱三重四级杆串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定4种雪莲培养物中9个水溶性维生素类成分的方法，分析比较不同雪莲悬浮细胞中维生素种类和含量差异。方法采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以 10 mmol·L-1乙酸铵(A)-乙腈(B)溶液为流动相，梯度洗脱，体积流量为0.5 mL·min-1，柱温为40 ℃；采用电喷雾离子源、正离子检测方式，得到相应的提取离子流图，以峰面积进行定量。结果9个维生素类成分具有良好的线性关系，r值均大于 0.999 0，方法精密度、重复性和稳定性的RSD值均小于4.28%，加样回收率在97.6%～103.4%，RSD在 1.83%～3.12%。不同雪莲悬浮细胞中9个维生素类成分在组成和含量上无明显差异。结论该方法操作简便、准确、重复性好，适用于雪莲悬浮细胞中水溶性维生素的测定。

雪莲；维生素；UPLC-MS/MS

雪莲，中药名为雪莲花，又称石莲、雪荷花，为菊科风毛菊属(Saussurea)植物天山雪莲Saussureainvolucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.的干燥地上部分，是藏族民间常用药，始载于藏族古代医药文献《月王药珍》[1]。雪莲花整株入药，性温，味微苦，入肝、脾、肾三经；具有散寒除湿、活血通络、温火助阳、抗炎镇痛、缩宫等功效[2]，民间常用于治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经和胎衣不下，以及麻疹不透、阳痿、肺寒咳嗽等症[3]。雪莲生长环境特殊，在海拔4000 m左右的悬崖峭壁之上，采摘不易；从扎根到开花需要5～7年的时间，加之其神奇的生物特征和独特的药理作用，被海内外誉为“百草之王”、“药中极品”[4]。近年来，全球变暖导致天山山脉雪面积减少，雪线上升，雪莲生存的环境不断缩小；再加上利益驱动，掠夺性采挖导致野生天山雪莲数量锐减。目前，雪莲已被国务院列为国家三级濒危植物[5]。雪莲培养物是运用细胞培养技术，甄选最佳野生天山雪莲种源，在严格控制的培养条件下，使雪莲细胞获得最佳的生存环境和充足的营养，同时经过上千次的筛选、培养，获得优质、高产细胞产品。2010年，雪莲培养物已被卫生部批准为新资源食品，其功效与天然雪莲相似，在抗炎镇痛、抗辐射、抗疲劳、抗氧化、提高免疫力等方面尤为突出[6]。雪莲培养物作为雪莲药材的替代品，客观上解决了雪莲资源严重匮乏的问题；加之其具有种源纯正、质量稳定、可持续供应的优点，是目前市场上热门的新食品原料。维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系，是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养元素，是食品中重要的功能因子。本研究以雪莲培养物为研究对象，以9个维生素为指标性成分，对其所含的维生素类成分进行含量分析；该法重复性好，精密度高，准确、灵敏，适合应用于雪莲培养物中维生素类成分的含量分析。

1 材料与仪器

1.1对照品

维生素类对照品共9个，分别是维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、维生素B5(北京融诚鑫德科技发展有限公司)；维生素B4、维生素B6、维生素B7、维生素C(上海士峰生物科技有限公司)；纯度均大于98%。

1.2 药材

雪莲培养物(大连普瑞康生物技术有限公司)，包括红、粉、绿、白等4个色系。

1.3 仪器和试剂

ACQUITY UPLCTMI-Class系统(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerTM3色谱工作站)，API 6500四级杆-线性离子阱质谱仪(美国ABSCIEX公司，配有离子喷雾接口)，SB-800 DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，New Classic MS-S电子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，Eppendorf 5810R离心机(德国Eppendorf 公司)。

色谱级甲醇和乙腈(美国Fisher Scientific公司)；甲酸(LC/MS分析用，美国Fisher Scientific公司)；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以10 mmol·L-1乙酸铵(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0 min，5% B；1.4 min，5% B；4 min，55% B)，流速为0.5 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为1 μL。对照品和样品的提取离子流图(XIC)见图1、2。

2.1.2 质谱条件 离子源：Turbo V，电离模式：ESI-，气帘气(CUR)体积流量：30 L·min-1；喷雾电压(IS)：5500 V；雾化气(GS1)体积流量：55 L·min-1；加热辅助气(GS2)体积流量：55 L·min-1；采集方式：MRM，离子化温度(TEMP)：550 ℃。优化的条件参数见表1。

表1 维生素类成分LC-MS/MS质谱条件优化

注：1.维生素B1；2.维生素B2；3.维生素B4；4.维生素B5；5.维生素B6；6.维生素B7；7.烟酸；8.烟酰胺；9.维生素C；下同。图1 各维生素对照品提取离子流图

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取样品细粉 2.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50 mL，称定质量，超声处理(功率 250 W，频率 40 kHz)40 min，称定质量，蒸馏水补足减少的质量，经 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B4、维生素B5、维生素B6、维生素B7、烟酸、烟酰胺、维生素C对照品适量，其中维生素B1用10%的甲酸水溶液配成单一成分对照品储备液，维生素B2用10%的氨水水溶液配成单一成分对照品储备液，维生素B7用甲醇配成单一成分对照品储备液，其他维生素用10 mmol·L-1乙酸铵-甲醇(9∶1)溶液分别配成单一成分对照品储备液。精密量取上述9种对照品溶液适量，加蒸馏水配制成每1 mL含维生素B142.3 μg、维生素B26.42 μg、维生素B4177.00 μg、维生素B55.88 μg、维生素B63.81 μg、维生素B70.516 μg、烟酸8.22 μg、烟酰胺1.77 μg、维生素C 2.59 μg的混合对照品溶液，放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 将上述混合对照品溶液进一步稀释成6个不同质量浓度的对照品溶液，按照2.1项下色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积Y为横坐标，进样质量浓度X(μg·mL-1)为纵坐标得到各维生素的回归方程分别为：维生素B1，Y=1.379×107X+4.082×107(r=0.999 6)，线性范围：0.423～21.15 μg·mL-1；维生素B2，Y=2.613×107X-9.264 6×104(r=0.999 1)，线性范围：0.032 1～3.21 μg·mL-1；维生素B4，Y=6.326×106X+4.806×106(r=0.999 6)，线性范围：0.177～80.5 μg·mL-1；维生素B5，Y=1.761×106X+7.506×104(r=0.999 0)，线性范围：0.058 8～5.88 μg·mL-1；维生素B6，Y=5.420×107X+1.540×106(r=0.999 5)，线性范围：0.003 81～0.381 μg·mL-1；维生素B7，Y=5.464×106X+2.558×105(r=0.999 9)，线性范围：0.002 58～0.258 μg·mL-1；烟酸，Y=2.039×106X+5.021×105，(r=0.999 4)，线性范围：0.082 2～8.22 μg·mL-1；烟酰胺，Y=6.663×106X+1.147×105(r=0.999 5)，线性范围：0.885～0.000 885 μg·mL-1；维生素C，Y=2.133×105X-1.338×104(r=0.999 3)，线性范围：0.0644～1.297 μg·mL-1。

图2 雪莲培养物样品提取离子流图

2.3.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液连续进样6次，分别记录9个维生素类成分的峰面积和保留时间，计算其RSD在0.46%～2.41%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一样品5份，按照2.2.1制备供试品溶液，进样测定，计算各维生素成分质量分数的RSD值在 1.53%～2.38%，表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一样品供试品溶液，分别在0、18、36、54、72、90 min测定9个维生素类成分的峰面积并计算其 RSD值在1.98%～4.28%，表明溶液在90 min内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取雪莲培养物样品9份，向其中加入高、中、低3个质量浓度(n=3)的对照品溶液。按照2.2.1方法处理后进样分析，每个质量浓度进行 3次样本分析，以计算所得的实际值与加入量的比值即为其准确度。9个维生素的平均加样回收率：维生素B1为98.5%，维生素B2为100.52%，维生素B4为102.6%，维生素B5为99.2%，维生素B6为98.6%，维生素B7为102.57%，烟酸为103.4%，烟酰胺为99.74%，维生素C 为97.6%，其 RSD 均小于3.12%。

3 样品测定

取4种雪莲培养物样品，分别按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项条件分析，以标准曲线法计算4种样品中9个维生素类成分的质量分数，结果见表2。

表2 雪莲培养物中维生素类成分质量分数(n=3)

4 讨论

本研究采用UPLC-MS/MS技术建立同时测定4种雪莲培养物中9个维生素灰成分含量的方法，具有准确度高、重复性好的特点。从含量测定结果来看，四种雪莲培养物中，粉色培养物总维生素含量最高，可达420.08 μg·g-1，其次是白色培养物和红色培养物，分别达403.37 μg·g-1和 340.6 μg·g-1，绿色培养物含量最低，只有216.7 μg·g-1。就单个维生素来看，维生素B4在4种培养物中含量均是最高的，是最主要的维生素来源。其他维生素含量相对较低。本研究的不足之处是缺乏雪莲花药材对照品，不能便于直观地对比药材和雪莲培养物中各维生素含量差异。

[1] 陈金瑞，王叶富，邱林刚，等.藏药雪莲花的化学成分[J].植物分类与资源学报，1989(3)：271-275.

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ContentsDeterminationofNineVitamininFourKindsofSuspensionCellsofXuelianbyUPLC-MS/MS

ZHANGYu1，YANGJian1*，ZHAOYuyang1，YANGGuang1，YUANYuan1*，LIUYaping2

(1.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsbreedingbase，NationalResourcesCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.PracticalBiotechnologyCo.，Ltd，Dalian116200，China)

Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of nine vitamins in four kinds of suspension cells of Xuelian，and analyze and investigate the difference of vitamin ingredients in samples from different suspension cells of Xuelian.MethodsThe determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；the 10 mmol·L-1ammonium acetate (A) and acetonitrile (B) in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1.The column temperature was 40 ℃.The MS instrument was equipped with ESI-ion source.Gaining the extracted ion chromatograms.ResultsNine vitamins had a good linear relationship，and thervalues were more than 0.999 0.The RSD values of the precision，repeatability and stability were less than 4.28%.the recoveries were 97.6%-103.4%，the RSD was 1.83%-3.12%.There were no significant differences in the composition and content of nine vitamins in the suspension cells of different Xuelian.ConclusionThe method is simple，accurate and reproducible.It is suitable for the determination of water-soluble vitamins in the suspension cells of Xuelian.

Saussureainvolucrata；vitamin；UPLC-MS/MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.008

科技基础性工作专项(2015FY111500)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(ZZ10-008)；863项目(SS2014AA022201)

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杨健，博士后，研究方向：中药鉴定与质量评价，E-mail：yangchem2012@163.com；袁媛，研究员，研究方向：中药鉴定与分子生药学，E-mail：y_yuan0732@163.com

2017-06-05)