周坚，郝刚

(苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104)

·中药工业·

UPLC-MS/MS法检测千柏鼻炎胶囊中阿多尼弗林碱△

周坚，郝刚*

(苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104)

目的基于超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)建立千柏鼻炎胶囊中阿多尼弗林碱的检测方法。方法以野百合碱为内标物，BEH-C18为分析柱，流动相为0.5%甲酸水溶液-乙腈(93∶7)，电喷雾电离(ESI+)，采用一级、二级扫描及多重反应检测(MRM)模式。结果所建方法能快速检测阿多尼弗林碱，在46.00～1.15 ng·mL-1内线性良好(r=0.9998)，平均加样回收率为95.9%，方法检出限为56 ng·g-1，方法重复性和精密度良好。结论所建方法快速、灵敏，适用于千柏鼻炎胶囊中阿多尼弗林碱的检测。

千柏鼻炎胶囊；超高效液相色谱-串联质谱法；阿多尼弗林碱

千柏鼻炎胶囊具有清热解毒、活血祛风的功能，临床上常用于风热犯肺、内郁化火、凝滞气血所致的鼻塞、鼻痒气热及慢性鼻炎、急慢性鼻窦炎等症状。其处方由千里光、卷柏、羌活、决明子、麻黄、川穹、白芷7味药组成，其中千里光为主要成分(占76.2%)[1]。千里光为菊科千里光属植物SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地上部分，其特征成分吡咯里西啶类生物碱具有强烈的肝毒性。目前已从千里光属植物分离的吡咯里西啶类生物碱(PAs)包括阿多尼弗林碱、千里光碱、克式千里光碱等[2-5]。2015年版《中华人民共和国药典》中千里光检查项下已有阿多尼弗林碱的限量检查，但千柏鼻炎胶囊项下未有相关检测规定。本实验基于UPLC-MS/MS法建立千柏鼻炎胶囊中阿多尼弗林碱的检测方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY xevo TQ-S超高效液相色谱仪-三重四级杆串联质谱仪(美国Waters公司)；Masslynx 4.1数据处理系统；KQ-300DA型数控型超声波清洗器(昆山舒美)；Thermo低温离心机；MILLIPORE纯水仪。

1.2 试药

阿多尼弗林碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111877-201201，质量浓度：0.092 μg·mL-1)；野百合碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111878-201102，纯度：100%)；实验用水为超纯水；其他试剂均为色谱纯。

千柏鼻炎胶囊样品为市售产品。

2 方法

2.1 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；毛细管电压4.0 kV；毛细管温度：350 ℃；脱溶剂气体流量：350 L·h-1；锥孔气流量：150 L·h-1；采用Daughter Scan子离子扫描及多反应检测模式(MRM)监测，检测参数见表1；氩气为碰撞气。

表1 质谱MRM检测参数

2.2 色谱条件

BEH-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A(含0.5%甲酸水溶液)-B(乙腈)，A∶B=93∶7(体积比)；柱温：30 ℃；进样器温度：15 ℃；流速0.3 mL·min-1；进样量：1 μL。

2.3 内标溶液制备

精密称取内标物野百合碱对照品适量，加0.5%甲酸溶液溶解、混匀，制成每1 mL含0.2 μg的内标溶液。

2.4 对照品溶液

取阿多尼弗林碱对照品(0.092 μg·mL-1)1 mL置10 mL量瓶中，加入内标溶液1 mL，

加0.5%甲酸溶液定容，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

2.5 供试品溶液制备

取胶囊内容物，研细，精密称定1.0 g置具塞锥形瓶中，精密加入0.5%甲酸溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min，冷却，再称定重量，以0.5%甲酸溶液补足减失重量，摇匀，过滤。取续滤液5 mL置10 mL量瓶中，加入内标溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.6 千里光阴性溶液制备

按2015年版《中华人民共和国药典》千柏鼻炎胶囊处方比例，取卷柏、决明子、麻黄3味加水煎煮二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加入羌活、川芎、白芷3味的细粉，混匀，干燥，粉碎，制成阴性样品，按2.5项下方法制成千里光阴性溶液。

3 结果

3.1 方法专属性

分别对阿多尼弗林碱对照品(0.092 μg·mL-1)、野百合碱(0.2 μg·mL-1)进行Daughter Scan质谱扫描，结果见图1，阿多尼弗林碱分子量为365.3。本实验采用Daughter Scan扫描模式得到阿多尼弗林碱准分子离子峰[M+H]+为m/z 366，主要二级碎片离子为m/z 338和138(图1A)，内标物野百合碱分子量为325.3，实验中得到其准分子离子峰[M+H]+为m/z 326，主要二级碎片离子为m/z 237和121(图1B)。

注：A.阿多尼弗林碱；B.野百合碱。图1 阿多尼弗林碱、野百合碱Daughter Scan扫描图

按表1参数建立MRM检测方法，阿多尼弗林碱对照品溶液(加内标)及内标野百合碱溶液的总离子流图(TIC)分别见图2A、2B，野百合碱保留时间为0.94 min，阿多尼弗林碱保留时间为1.39 min。

注：A.阿多尼弗林碱对照品溶液(加内标)；B.野百合碱。图2 阿多尼弗林碱对照品溶液(加内标)、野百合碱TIC图

进一步考察千里光阴性样品溶液，结果表明，在所建方法下阴性样品对阿多尼弗林碱及内标野百合碱的测定均无干扰。供试品溶液(加内标)TIC图见图4，千柏鼻炎胶囊供试品对内标野百合碱无干扰，所建方法专属性良好。

注：A.无内标；B.加内标。图3 阴性样品TIC图

图4 供试品溶液TIC图

3.2 线性范围、检出限与定量限

精密量取阿多尼弗林碱对照品(0.092 μg·mL-1)，用0.5%甲酸溶液稀释成46.00、23.00、4.60、2.30、1.15 ng·mL-1的对照品溶液，分别取1 mL上述溶液至置10 mL量瓶中，加入内标溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，摇匀，取1 μL进样分析，以TIC图对照品与内标峰面积比为纵坐标(Y)，各对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程：Y=2131X+191.2，r=0.999 8。以信噪比S/N=10确定定量限为1.15 ng·mL-1，以信噪比S/N=3确定检测限为0.56 ng·mL-1。根据2.5项下的方法，样品实际稀释倍数为100，计算该方法下阿多尼弗林碱的方法检出限为56 ng·g-1，方法定量限为115 ng·g-1。

3.3 精密度

精密量取阿多尼弗林碱对照品(0.092 μg·mL-1)0.5 mL至置10 mL量瓶中，加入内标溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，摇匀，连续进样6次，阿多尼弗林碱与野百合碱峰面积比值的RSD为1.2%，表明精密度良好。

3.4 稳定性

取供试品，按2.5项下方法进行处理，分别于0、2、4、8、12、24 h测定，结果阿多尼弗林碱与野百合碱峰面积比值的RSD为2.5%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

3.5 重复性

取供试品6份，按2.5项下方法进行处理，内标法计算阿多尼弗林碱平均质量分数为0.22 μg·g-1，RSD为1.8%，方法重复性良好。

3.6 回收率

取千柏鼻炎胶囊供试品6份(阿多尼弗林碱质量分数0.22 μg·g-1)，每份0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入阿多尼弗林碱对照品溶液2 mL，加入0.5%甲酸溶液48 mL，按2.5项下方法进行处理，内标法计算6份样品回收率分别为101.5%、92.1%、98.4%、95.7%、99.2%、100.3%，平均回收率为95.9%，RSD=3.6%。

3.7 样品测定

取市售千柏鼻炎胶囊10批，按2.5项下方法进行处理，每批样品制备2份，按所建方法测定样品中阿多尼弗林碱的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

注：“—”表示测定结果小于方法检出限。

4 讨论

液质联用技术将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点相结合，实现了色谱和质谱的优势互补，目前已被广泛应用于药品质量控制研究领域[6]。与高效液相色谱法相比，超高效液相色谱-串联质谱技术由于采用了2.0 μm以下的色谱柱填料，进一步缩短了分析时间，提高了分析的通量和灵敏度，尤其适合痕量物质的检测[7-8]。

作为千里光药材安全性评价的主要指标成分，阿多尼弗林碱在不同地产千里光药材中含量分布差异较大，有文献报道[9]，我国浙江、安徽、云南等地产千里光中所含的吡咯里西啶类生物碱(PAs)主要为阿多尼弗林碱，广东产千里光的主要PAs为克式千里光碱[10]，而熊爱珍等[4]在欧洲千里光中未检测出阿多尼弗林碱。此外，阿多尼弗林碱化学结构上无生色团，紫外响应弱[4]。因此，现行2015年版《中华人民共和国药典》采用液质联用技术对千里光中的阿多尼弗林碱进行限量检查，并规定其含量不得过0.004%(40 μg·g-1)[1]。

千柏鼻炎胶囊、千柏鼻炎片等中成药中的主要成分为千里光，2004年英国药品和保健品管理机构(MHRA)考虑到千柏鼻炎片(胶囊)的吡咯里西啶类生物碱(阿多尼弗林碱等)严重的肝损伤作用，对千柏鼻炎片(胶囊)等含千里光属(植物)内服中成药禁止进口和销售[11-12]。此外，国内也曾出现过千柏鼻炎片引起肝脏损害的相关报告[13]。为进一步加强千柏鼻炎胶囊(片)的质量标准研究，本实验基于UPLC-MS/MS方法建立了千柏鼻炎胶囊中阿多尼弗林碱的检测方法。与现行《中华人民共和国药典》方法相比，本实验采用多反应检测(MRM)，选取阿多尼弗林碱两个特征碎片离子进行检测，进一步增强了质谱检测的专属性，提高待测化合物及内标物的灵敏度[14-16]，仪器定量限为1.15 ng·mL-1，方法定量限为115 ng·g-1。

5 结论

本实验基于UPLC-MS/MS技术，利用多反应检测模式(MRM)建立了千柏鼻炎片中阿多尼弗林碱的检测方法，方法专属性强、灵敏度高、稳定性好、分析时间短，能够满足实际样品的检测需求，为千柏鼻炎片等中成药中阿多尼弗林碱的质量控制提供了实验依据。

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DetectionofAdonifolineinQianbaiBiyanCapsulesbyUPLC-MS/MS

ZHOUJian，HAOGang*

(SuzhouInstituteforDrugControl，JiangsuSuzhou215104，China)

Objective：To establish a specific，sensitive and rapid UPLC-MS/MS method for determination of adonifoline in Qianbai Biyan capsules.MethodsMonocrotaline was used as an internal standard.Samples were detect by the ultra performance liquid chromatography-electrospray ion(ESI+)trap mass spectrometry method.The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18column with an isocratic elution(0.5% acetic acid：acetonitrile=93∶7).The qualitative and quantitative analysis of adonifoline was conducted in the MS Scan，Daughter Scan and MRM mode by UPLC-MS/MS.ResultsThe calibration curves showed a good linear relationship in the range of 46.00-1.15 ng·mL-1for the component(r=0.999 8).The determination limits was 56 ng·g-1and the average recovery rate was 95.9%.Good reproducibility and precision was also achieved.ConclusionThe method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to analyze adonifoline in Qianbai Biyan capsules.

Qianbai Biyan capsules；UPLC-MS/MS；adonifoline

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.022

苏州市民生科技-医疗卫生基础研究项目(SYS201663)

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郝刚，副主任药师，研究方向：药品质量与安全监控研究；Tel：(0512)68222721，E-mail：haogang531@163.com

2017-03-20)