王妮++闫唯++李佳++赵二劳

摘 要：为了研究温度对旱柳叶中黄酮提取率及抗氧化活性的影响，试验采用超声辅助提取旱柳叶中黄酮，测定了不同温度下旱柳叶黄酮的提取率及对DPPH·和·OH的清除率。结果表明：提取温度对旱柳叶中黄酮提取率有较大影响，不同温度下，旱柳叶黄酮提取率的大小顺序为：60℃>50℃>70℃>40℃>30℃。旱柳叶中黄酮的最佳提取温度为60℃，提取率为2.51%。提取温度对旱柳叶黄酮抗氧化活性基本无影响。

关键词：旱柳叶；温度；黄酮；提取率；抗氧化性

中图分类号：TS202.3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20171232002

旱柳（Salix matsudana Koidz）为杨柳科柳属落叶乔木，在我国各地特别是北方地区充当园林绿化和植树造林的先锋树种，栽种颇多，分布广泛，资源很是丰富。旱柳叶为旱柳树的叶子是我国常用中藥，药用历史悠久。《本草纲目》中记载，柳为本经下品，其性苦寒，无毒，可治风水黄疸、疮痈肿毒、炎热淋疾等症[1]。现代科学研究表明[2]，旱柳叶中含有黄酮类成分，具有诸多药理功能活性，如延缓衰老、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血脂等，在大健康时代对促进人体健康能发挥积极作用。因此，旱柳叶中黄酮的研究应用，日益引起人们的兴趣。张晶等[3]对旱柳叶化学成分进行了分离鉴定和药理活性测定，从中分离出3种黄酮单体化合物，认为这些化合物对血栓的形成和动脉硬化有防治作用；刘畅等[4]研究认为旱柳叶黄酮具有较强的抗氧化活性；王立娟等[5]研究了旱柳叶中黄酮的超声波辅助提取工艺，通过正交试验优化确定了最佳提取工艺条件。但这些研究均未涉及提取温度对黄酮提取率和抗氧化性的影响。因此，为进一步深入研究开发应用旱柳叶黄酮，提高旱柳叶的综合应用价值，本试验采用超声波辅助提取旱柳叶黄酮，研究不同温度对黄酮提取率及抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

旱柳叶2016年10月采集于忻州师范学院主校区，自来水冲洗干净，在恒温干燥箱中50℃下烘干，药材粉碎机粉碎后，过40目筛，装瓶保存待用。

1，1-二苯肼-2-苦肼基（DPPH·），（日本东京化成工业株式会社）；芦丁标准对照品，（北京化学试剂公司）；其余试剂都为分析纯，购自天津市风帆化学试剂有限公司；试验用水为二次去离子水，由化学系实验中心提供。

1.2 试验主要仪器

高功率数控超声波清洗器（KQ-400KD型）；紫外可见分光光度计（SP-723型）；水浴恒温振荡器（THZ-82型）；电子分析天平（AL204型）；循环水式真空泵（SHZ-D（Ш）型）；电热鼓风干燥箱（DGF20022型）。

2 试验方法

2.1 旱柳叶预处理

将粉碎过40目筛的旱柳叶粉中按1：10的比例加入石油醚脱脂24h后，抽滤，滤渣置50℃恒温干燥箱中烘干，即为旱柳叶样品，存放待用。

2.2 旱柳叶黄酮提取工艺流程

以体积分数50%的乙醇溶液为提取剂，在料液比、超声功率和时间（料液比1：55、超声功率400W、时间60min）相同的条件下，选取30℃、40℃、50℃、60℃和70℃5个不同的温度，进行旱柳叶中黄酮的超声波辅助提取[4]。

黄酮提取工艺流程：经预处理旱柳叶粉→超声辅助提取→抽滤→定容→黄酮提取液。

2.3 旱柳叶黄酮提取率的测定

本试验以芦丁作标准对照品，参考文献[4]采用硝酸铝比色法测定旱柳叶中黄酮含量，并计算黄酮提取率。

2.3.1 芦丁标准工作曲线的制备

参考文献[4，6]方法稍作改动制备芦丁标准曲线。准确吸取浓度为0.5mg/mL的芦丁标准对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分别置于6支25mL比色管中，然后都加入质量分数5%亚硝酸钠溶液1.0mL，充分摇匀后，每支比色管中都加入质量分数10%的硝酸铝溶液1.0mL，再充分摇匀，再于每支比色管中都加入质量分数4%的氢氧化钠溶液10.0mL，最后用体积分数50%的乙醇溶液定容至25mL，摇匀后静置反应15min，以2次去离子水为空白对照，在510nm最大波长下用分光光度计分别测定其吸光度。然后，以芦丁标准品质量浓度（mg/mL）为横坐标，所测吸光度值为纵坐标，制备芦丁吸光度（A） ～质量浓度（c）标准工作曲线，由芦丁标准工作曲线求得回归方程为：

A = 11.723c-0.0055，相关系数R2 = 0.9999。

2.3.2 旱柳叶黄酮提取率的测定

吸取不同温度下黄酮提取液2.0mL，按2.3.1中方法测定其黄酮含量，根据公式：黄酮提取率 （%） =（提取液中黄酮质量（mg） / 旱柳叶质量（mg））×100，计算旱柳叶黄酮提取率。

2.4 旱柳叶中黄酮抗氧化性测定

一般采用自由基清除法评价物质抗氧化性，本试验采用DPPH·和·OH清除法来评价旱柳叶黄酮的抗氧化性。

2.4.1 旱柳叶黄酮对DPPH·的清除率

试验参考文献[7，8]的方法稍作改动，进行对DPPH·清除率的测定。准确移取质量浓度0.20mg/mL的 DPPH·溶液3.0mL，置于10mL比色管中，再加入定量的旱柳叶黄酮提取液，然后用体积分数50%乙醇溶液定容至10mL，摇匀，静置于室内避光处，待反应30min后，在517nm最大波长下，测定该溶液体系的吸光度。测得：不加旱柳叶黄酮提取液仅DPPH·溶液体系的吸光度为A0；不加DPPH·溶液仅旱柳叶黄酮提取液体系的吸光度为Aj；旱柳叶黄酮提取液+DPPH·溶液体系的吸光度为Ai。不同温度提取的旱柳叶黄酮溶液都做3次平行试验，然后根据公式：清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0]×100，计算旱柳叶黄酮对DPPH·的清除率。endprint

2.4.2 旱柳叶黄酮对·OH的清除率

试验参考文献[8，9]方法并作一定改动后，进行对·OH清除率测定。准确移取质量浓度0.03mol/L硫酸亚铁铵溶液1.0mL，置于10mL比色管中，再加入质量浓度0.03mol/L水杨酸溶液1.0mL，然后加入质量分数0.3%过氧化氢溶液1.0mL，用2次去离子水定容至10mL，摇匀，置于40℃恒温水浴中反应30min，取出冷却至室温后，用分光光度计在510nm最大波长下，测得该溶液体系的吸光度为A0；测得加入一定量旱柳叶黄酮提取液后上述溶液体系的吸光度为Ai。。不同温度提取的旱柳叶黄酮溶液都做3次平行试验，然后根据公式：清除率（%）= [（A0-Ai）/A0]×100，计算旱柳叶黄酮对·OH的清除率。

3 结果与分析

3.1 温度对旱柳叶黄酮提取率的影响

不同温度下旱柳叶黄酮提取率测定结果见图1。

由图1可见，不同温度下，旱柳叶中黄酮的超声波辅助提取率不同。在不同温度下，旱柳叶黄酮提取率的大小顺序为：60℃>50℃>70℃>40℃>30℃，温度60℃时旱柳叶中黄酮提取率最高，可达2.51%，为旱柳叶黄酮超声辅助提取的最佳温度。计算比较不同温度时黄酮提取率的差异性，可知，60℃与70℃相比差异不显著（P>0.05）；与50℃相比差异显著（P<0.05）；与40℃或30℃相比差异极显著（P<0.01）。这与陈建福等[10]研究白兰叶中黄酮提取和罗磊等[11]研究金银花叶黄酮提取所得结论一致。在30～70℃的试验温度范围内，随着提取温度的升高，旱柳叶黄酮提取率呈先升高后下降，这是因为温度升高，加快了分子运动速率，提高了黄酮的溶解度，提取率增加。但当温度继续升高，温度过高影响黄酮的热稳定性，黄酮容易在过高的温度下发生氧化或降解，导致提取率下降[10-12]。得出各种天然产物中黄酮类活性成分均有一最适溶出温度，在进行提取研究时，应充分考虑提取温度的选择。

3.2 旱柳叶黄酮抗氧化活性测定

3.2.1 对DPPH·清除率

按试验方法，测定质量浓度30μg/mL黄酮提取液对DPPH·清除率，结果如图2所示。

由图2可以看出，不同温度下提取的旱柳叶黄酮在浓度相同时、对DPPH·清除率的大小顺序为：60℃>50℃>40℃>30℃>70℃。60℃提取的旱柳叶黄酮对DPPH·清除率最高可达83.64%。相同浓度时，不同温度下提取的旱柳叶黄酮对DPPH·清除率的差异性不大，基本在同一水平。表明提取温度对旱柳叶中提取的黄酮种类及其抗氧化活性基本无影响。

3.2.2 对·OH清除率

按试验方法，测定质量浓度为100μg/mL的黄酮提取液对·OH清除率，结果如图3所示。

由图3可以看出，不同温度下提取的旱柳叶黄酮在浓度相同时对·OH清除率的大小顺序为：50℃>60℃>40℃>30℃>70℃。50℃提取的旱柳叶黄酮对·OH的清除率最高可达57.23%。在相同浓度时，不同温度下提取的旱柳叶黄酮对·OH清除率的差异性不大。也表明提取温度对旱柳叶中提取的黄酮种类及其抗氧化活性基本无影响。

4 結论

本试验结果表明，提取温度对旱柳叶中黄酮提取率有较大影响，旱柳叶中黄酮超声辅助提取最佳温度为60℃，该温度下，旱柳叶黄酮提取率为2.51%。试验也表明，不同温度下提取的旱柳叶黄酮对DPPH·清除率的差异性不大，对·OH清除率的差异性也不大，说明提取温度对旱柳叶中黄酮提取的种类及其抗氧化活性基本无影响。

参考文献

[1]郑毅男，徐宝军，张晶，等.旱柳叶活性成分研究[J].药学实践杂志，2000，18（5）：280-283.

[2]韩立芹，姜盼，金沙，等.旱柳叶中三种黄酮类成分以水杨苷含量的高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2012，23（2）：396-398.

[3]张晶，郑毅男，韩立坤.旱柳叶抗血栓、抗动脉硬化活性成分的研究[J].中药材，1999，22（3）：131-133.

[4]刘畅，郭建红，赵鑫鹏，等.旱柳叶中黄酮及其抗氧化活性的测定[J].山东化工，2016，45（16）：67-68，70.

[5]王立娟，李坚，谷肄静.超声波辅助提取旱柳树叶中的总黄酮[J].林产化学与工业，2007，27（S1）：133-136.

[6]林晓，马艳蕾，张莱娣，等.星点设计法优化黄芪总黄酮提取工艺及抗氧化活性测定的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2015（15）：204-207，302.

[7]麻文胜，黎国庆，钟华锋，等.油梨仁提取物的体外抗氧化活性研究[J].食品工业，2017，38（2）：96-99.

[8]石秀花.超声波提取野玫瑰色素及体外抗氧化性分析 [J].食品研究与开发，2017，38（9）：90-94.

[9]张晶，杨晓杰，孙百良，等.温度对桔梗多糖提取率及抗氧化的影响 [J].黑龙江畜牧兽医， 2016（18）：161-163.

[10]陈建福，林洵，林萍萍，等.响应面法优化超声辅助提取白兰叶总黄酮工艺[J].食品工业科技，2016，37（15）：238-242.

[11]罗磊，张冰洁，朱文学，等.响应面试验优化超声辅助提取金银花叶黄酮工艺及其抗氧化活性[J].食品科学，2016，37（6）：13-19.

[12] Jin H M，Tan X H，Cai W，et al.Optimization of extraction technology of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata using response surface methodology[J].Journal of Food Safety and Quality，2015，6（5）：1575-1582.

作者简介：王妮（1996-），女，本科，实验师，从事天然产物活性成分研究；赵二劳（1952-），男，本科，教授，从事天然产物活性成分研究。endprint