刘军麟 曾慧明 林岷格 鞠梅 吴智明 李梅娇 李毓阳 殷梅

570311海口，海南医学院第二附属医院皮肤性病科（刘军麟），检验科（吴智明），体检中心（殷梅）；海南医学院第一附属医院皮肤性病科（曾慧明、林岷格）；中国医学科学院北京协和医学院 皮肤病研究所理疗科（鞠梅）；海南省中医院皮肤性病科（李梅娇）；海南省第三人民医院皮肤性病科（李毓阳）

·论著·

维生素D受体基因多态性与寻常性银屑病易感性及卡泊三醇疗效的相关性

刘军麟 曾慧明 林岷格 鞠梅 吴智明 李梅娇 李毓阳 殷梅

570311海口，海南医学院第二附属医院皮肤性病科（刘军麟），检验科（吴智明），体检中心（殷梅）；海南医学院第一附属医院皮肤性病科（曾慧明、林岷格）；中国医学科学院北京协和医学院 皮肤病研究所理疗科（鞠梅）；海南省中医院皮肤性病科（李梅娇）；海南省第三人民医院皮肤性病科（李毓阳）

目的探讨维生素D受体（VDR）基因多态性与寻常性银屑病易感性及卡泊三醇软膏疗效的关系。方法收集110例寻常性银屑病患者与183例健康对照，均为海南籍汉族人，采用连接酶检测反应对受试者rs2228570、rs731236、rs1544410及rs7975232位点基因分型，进行基于单核苷酸多态性和单倍型的病例-对照联分析。75例银屑病面积和严重程度指数（PASI）＜10的患者单用卡泊三醇软膏治疗，6周后评估其疗效，并与个体的基因型进行关联分析。结果银屑病组rs7975232位点等位基因A的频率为39.09%，对照组为27.05%，携带该等位基因的个体患病风险高于非携带者（OR=1.731，95%CI:1.213～2.471，P＜0.05）；AA基因型与AC基因型个体患病风险高于CC基因型个体（分别为 OR=2.404，95%CI：1.085 ～ 5.328，P＜ 0.05；OR=2.143，95%CI：1.283 ～ 3.579，P＜0.05）。携带CTGA（分别对应 rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位点）单倍体的个体患病风险高于非携带者（OR=1.907，95%CI：1.132～3.214，P＜ 0.05）。在72例PASI＜10的轻、中度银屑病患者中，卡泊三醇对rs7975232位点为CC基因型患者的疗效好于AC基因型患者（OR=3.798，95%CI:1.061～13.590，P＜0.05）和AA基因型患者（OR=9.667，95%CI:1.556～60.040，P＜0.05）。结论寻常性银屑病患病风险及卡泊三醇疗效差异与维生素D受体基因多态性相关。

银屑病；受体，骨化三醇；多态性，单核苷酸；单倍型；卡泊三醇

银屑病是常见遗传性疾病，其特征是角质形成细胞的过度增殖和角化不全［1］。1，25二羟维生素D3是维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）的配体。激素-受体复合体结合激素反应元件后，可抑制培养的角质形成细胞增殖，诱导其分化，并通过多种途径调节免疫系统［2］。VDR基因位于12q13.11，约有200多个单核苷酸多态（single nucleotide polymorphisms，SNP）［3］。迄今为止，有多个研究探索VDR基因与银屑病的关系，其中大部分研究集中在rs2228570：C＞T（外显子2起始编码区）、rs1544410：G ＞ A（内含子8）、rs7975232：T ＞ G（内含子8）和rs731236：T ＞ C（外显子9）位点。这4个位点可通过限制性片段长度多态性的方法分别用内切酶FokⅠ、BsmIⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ进行酶切识别，因而又习惯性分别命名为FokⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ位点［4］。本研究探讨VDR基因rs2228570：C ＞ T、rs1544410：G ＞ A、rs7975232：T ＞ G 和rs731236：T＞C位点与寻常性银屑病发病以及维生素D类似物卡泊三醇软膏疗效的相关性。

对象与方法

一、对象

海南医学院第二附属医院、海南医学院第一附属医院皮肤科门诊和病房的海南籍汉族寻常性银屑病患者110例，其中男67例，女43例，年龄8～75（35.27±14.96）岁。从海南医学院第二附属医院体检中心收集海南籍汉族健康体检人员183例（男104例，女79例）作为健康对照，年龄10～ 67（33.83± 13.26）岁，健康对照及其家庭成员均无银屑病史，且与入选的银屑病患者无血缘关系。两组的性别和年龄差异无统计学意义（P值分别为0.493、0.392）。本研究通过海南医学院第二附属医院医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

二、方法

1.SNP分型：采用连接酶检测反应（ligase detection reactions，LDR）进行SNP分型。采集受试者外周静脉血，用基因组DNA提取试剂盒（美国Axygene公司）提取基因组DNA进行多重PCR扩增，反应体系（20 μl）：50 ng/L模板DNA 1 μl，1 × 缓冲液 2 μl，3 mmol/L MgCl20.6 μl，2 mmol/L dNTP 2 μl，Taq酶1 U，0.5 μmol/L混合引物2 μl，不足部分用双蒸水补充；反应程序：95℃预变性2 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，65℃延伸30 s，40个循环后65℃延伸10 min。扩增后进行连接反应，反应体系（10 μl）：1 × 缓冲液1 μl，2 μmol/L混合探针各1 μl，Taq酶2 U，PCR产物4 μl，不足部分用双蒸水补充；反应程序：95℃预变性2 min，94℃变性15 s，50℃延伸25 s，共40个循环。由ABI 377测序仪完成SNP分型，并用Genemapper软件分析。为保证分型结果的正确性，随机抽取每种基因型的样本进行直接测序验证。PCR反应引物、LDR探针由上海翼和应用生物技术有限公司合成，序列见表1、2。

表1 维生素D受体基因4个位点的PCR引物序列

2.银屑病病情评估及治疗：对110例患者进行银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）评分，PASI＜ 10且符合下列条件的轻、中度银屑病患者纳入卡泊三醇软膏治疗组：①初发患者，近1个月未因银屑病或其他疾病接受糖皮质激素类、维生素D类似物或维A酸类等对银屑病具有治疗作用的药物外用治疗；②近1个月未使用且之后6周不需系统应用糖皮质激素类、维A酸类药物、复方甘草酸苷、甘草酸二铵、雷公藤多苷或免疫抑制剂。治疗方法：皮损处外用卡泊三醇软膏2次/d，若有必要可加用保湿剂，不系统使用或外用其他对银屑病有治疗作用的药物。6周后评估疗效，PASI评分改善75%及以上评定为有效。

3.统计分析：采用PLINK 1.07软件，进行基于SNP和单倍型的病例-对照关联分析，在对照人群中进行Hardy⁃Weinberg平衡检验。卡泊三醇软膏对VDR不同基因型患者疗效的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 维生素D受体基因4个位点的连接酶检测反应探针序列

表3 维生素D受体基因4个位点在寻常性银屑病患者组和健康对照组中的基因型和等位基因频率［n（%）］

结 果

一、SNP和单倍型的病例-对照关联分析结果

两组rs731236、rs1544410、rs7975232、rs2228570位点基因型和等位基因频率见表3。随机抽取每种基因型各1例进行直接测序验证，其结果与LDR分型结果一致。对照组中4个位点的基因型均符合Hardy⁃Weinberg平衡（HWEP值分别为 0.647、0.080、0.328、0.369）。rs7975232（C ＞ A）位点上，携带等位基因A的个体，其寻常性银屑病的患病风险高于非携带者（P=0.003 3）；携带AA基因型与AC基因型的个体寻常性银屑病的患病风险高于携带CC基因型者（P值分别为 0.0340、0.0045）。在rs2228570（T ＞ C）、rs1544410（G ＞ A）、rs731236（C ＞T）位点上，不同基因型和等位基因的个体之间寻常性银屑病的患病风险差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

基于单倍型的分析结果显示，频率＞5%的单倍型有4种，分别为TTGA（分别对应rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位点）、CTGA、TTGC、CTGC型，其中CTGA型在患者组和对照组中的频率分别为14.78%和8.47%，携带CTGA单倍型的个体患病风险高于非携带者，差异有统计学意义（OR=1.907，95%CI：1.132 ～ 3.214，P=0.019 5）。

二、卡泊三醇软膏对寻常性银屑病的疗效

110例寻常性银屑病患者中，75例PASI＜10，为轻、中度银屑病患者，单用卡泊三醇软膏治疗6周，72例完成随访，其中53例有效，19例无效。在4个位点中，rs7975232位点基因型CC、AC、AA的频率在有效和无效患者中的分布差异有统计学意义（P＜0.05），且携带rs7975232 CC基因型的患者（22例）对卡泊三醇软膏的疗效好于携带AC基因型（32例，P=0.042）和AA基因型（7例，P=0.020）患者。而其他3个位点不同基因型患者的疗效差异均无统计学意义。见表4。

表4 72例PASI＜10的轻、中度银屑病患者VDR基因4个位点基因型与卡泊三醇软膏疗效的关系［例（%）］

讨 论

1997年，Kontula等［5］通过对VDR基因与银屑病发病的关联分析发现rs1544410不是银屑病的易感位点。之后，Park等［6］报道，rs7975232可能是韩国人寻常性银屑病的易感位点；而Lee等［7］报道，rs1544410不是韩国人寻常性银屑病的易感位点。来自日本的一项研究显示，rs1544410、rs731236是银屑病的易感位点［8］；另一个来自日本的研究则排除了rs7975232、rs1544410和rs731236位点［9］。来自中国的研究显示，在华东人群中，rs7975232、rs1544410是银屑病的易感位点［10］；而在东北人群中，只有rs7975232是银屑病的易感位点［11］。本研究中，寻常性银屑病患者rs7975232等位基因A频率高于对照组，携带等位基因A的个体患病风险高于不携带者；相对于CC基因型，AC或AA基因型个体银屑病患病风险更高。本研究与前述的国内研究结果类似。但在东亚或世界范围内，针对同一个基因甚至同一个SNP的关联分析，其结果可能不完全一致。

本研究还进行了基于单倍型的关联分析，结果显示，携带CTGA（rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位点）单倍型的个体寻常性银屑病的患病风险更高。此结果与Zhou等［11］的报道即3个位点构 建 的 单 倍 型 GCT（rs1544410、rs7975232、rs731236）携带者银屑病患病风险降低类似；另一项德国研究证实，该单倍型与重度特应性皮炎关联［12］。克罗地亚的研究则显示，任何包含rs1544410、rs7975232或rs731236的单倍型均与银屑病发病风险相关［13］。上述结果提示，不同国家间单倍型的研究结果也不完全一致，因而，需要进行功能研究，以探索等位基因或单倍型变异是否可能对VDR基因的生物学功能产生影响。

Morrison等［14］报道，等位基因b可能降低VDR mRNA的表达。另有报道称，等位基因F的转录效率比等位基因f更高［15］。Colin等［16］报道，在植物血凝素刺激的外周血单核细胞生长阻断实验中，用1，25-二羟维生素D3刺激时，FF基因型个体的半数有效量低于Ff基因型。而对于单倍型，有报道认为，baT和BAt与等位基因的特异表达、VDR mRNA降解、巨噬细胞功能以及Th1/Th2细胞因子分化均有关［17⁃19］。Heine等［12］研究亦显示，在严重特应性皮炎患者中（rs1544410/rs7975232/rs731236）GCT纯合子较AAC携带者对骨化三醇所致的VDR激活过程更敏感，VDR mRNA水平更高。本研究证实，rs7975232等位基因A是寻常性银屑病的风险等位基因。rs7975232位于内含子8，推测其可能通过改变RNA剪接、编辑或通过影响受体蛋白折叠以及与DNA反应元件的亲和力而改变其功能，从而导致个体对银屑病易感。在rs7975232位点上，对CC基因型的寻常性银屑病患者，卡泊三醇软膏的疗效好于携带其他基因型的个体。本研究的结果提示，rs7975232等位基因A是银屑病的风险等位基因，而等位基因C则可能是银屑病的保护基因。维生素D类似物对具有rs7975232 CC基因型的个体具有更好的疗效这一现象与等位基因C是银屑病的保护基因这一结果是否缘于同一机制尚不清楚，确切的机制尚需后续的实验探索。

综上所述，rs7975232可能是寻常性银屑病的易感位点，rs2228570/rs731236/rs1544410/rs7975232 CTGA是银屑病的风险单倍型，卡泊三醇对rs7975232位点为CC基因型的个体疗效更好。但是，本研究样本量有限，后续研究应增加样本量，以使结果更具说服力。

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Association of vitamin D receptor polymorphisms with susceptibility to psoriasis vulgaris and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis vulgaris

Liu Junlin,Zeng Huiming,Lin Min′ge,Ju Mei,Wu Zhiming,Li Meijiao,Li Yuyang,Yin Mei
Department of Dermatology and Venereology,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Liu JL）;Clinical Laboratory,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Wu ZM）;Health Examination Center,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Yin M）;Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,China（Zeng HM,Lin MG）;Department of Physical Therapy,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Ju M）;Department of Dermatology and Venereology,Chinese Medicine Hospital of Hainan Province,Haikou 570203,China（Li MJ）;Department of Dermatology and Venereology,The Third People′s Hospital of Hainan Province,Sanya 572000,China（Li YY）

Liu Junlin,Email:liujunlin0759@163.com

ObjectiveTo investigate association of vitamin D receptor（VDR）polymorphisms with susceptibility to psoriasis vulgaris and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis vulgaris.MethodsA total of 110 patients with psoriasis vulgaris and 183 healthy controls were enrolled into this study,and they were all of Han nationality from Hainan province.Ligase detection reaction（LDR）was conducted to determine the genotypes of VDR gene polymorphisms rs2228570,rs731236,rs1544410 and rs7975232.Single nucleotide polymorphism（SNP）⁃based association analysis in genotypic and allelic models,and haplotype⁃based association analysis were then performed.Then,75 patients with psoriasis area and severity index（PASI）scores less than 10 were topically treated with calcipotriol ointment alone.After 6⁃week treatment,the efficacy of calcipotriol ointment was evaluated,and the correlation between the efficacy and individual genotypes was analyzed.ResultsThe frequency of A allele of rs7975232 in the psoriasis group and control group was 39.09%and 27.05%respectively,and the risk of developing psoriasis in rs7975232 A allele carriers was significantly higher than that in non⁃carriers（OR=1.731,95%CI:1.213-2.471,P＜ 0.05）.Additionally,the risk of developing psoriasis in individuals with AA genotype（OR=2.404,95%CI:1.085-5.328,P＜ 0.05）,as well as in individuals with AC genotype（OR=2.143,95%CI:1.283-3.579,P＜ 0.05）,was significantly higher than that in patients with CC genotype.CTGA haplotype carriers（rs2228570,rs731236,rs1544410,rs7975232,respectively）had significantly higher risk of developing psoriasis compared with non⁃carriers（OR=1.907,95%CI:1.132-3.214,P＜ 0.05）.Among 72 patients with mild⁃to⁃moderate psoriasis whose PASI scores were less than 10,patients with CC genotype of rs7975232 showed better response to calcipotriol ointment compared with those with AC genotype（OR=3.798,95%CI:1.061-13.590,P＜ 0.05）and those with AA genotype（OR=9.667,95%CI:1.556-60.040,P＜ 0.05）.ConclusionVDR polymorphisms are associated with psoriasis susceptibility and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis individuals.

Psoriasis;Receptors,calcitriol;Polymorphism,single nucleotide;Haplotypes;Calcipotriol

Fund program:Natural Science Foundation of Hainan Province of China（814344）

刘军麟，Email：liujunlin0759@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.007

海南省自然科学基金（814344）

2017⁃05⁃31）

朱思维 颜艳）