孟盼 黄会珍 杨琴 赵洪庆 杨蕙 韩远山 凌佳 王宇红

摘要：目的 觀察逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症模型小鼠的影响，探讨其作用机制。方法 以BALB/c雌性小鼠为研究对象，采用腋下注射4T1炎性乳腺癌细胞联合腹腔注射皮质酮（CORT）建立乳腺癌并发抑郁症模型小鼠。根据糖水消耗量随机分为空白组、模型组、紫杉醇组、逍遥抗癌解郁方组、化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组，分别给予相应药物21 d后，采用糖水偏好实验、Open-field实验和新奇摄食实验检测小鼠行为学变化；ELISA检测小鼠血浆促肾上腺激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、CORT，血清5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE），肿瘤标志物糖类抗原CA153、CA125和癌胚抗原（CEA）的含量。结果 与空白组比较，模型组小鼠糖水偏好度、水平与垂直运动明显降低（P<0.01，P<0.05），摄食潜伏期明显增加（P<0.01，P<0.05），肿瘤标志物CA153、CA125和CEA含量及下丘脑-垂体-肾上腺轴相关指标显著升高（P<0.01）；单胺神经递质NE、DA和5-HT明显下降（P<0.01）；与模型组比较，化疗+逍遥抗癌解郁方组小鼠糖水消耗量显著升高，自主行为活动增加，行为绝望状态改善（P<0.01，P<0.05）；肿瘤标物及HPA轴相关指标含量明显降低（P<0.01，P<0.05）；5-HT、DA和NE含量明显升高（P<0.01，P<0.05）。结论 逍遥抗癌解郁方联合紫杉醇可有效缓解乳腺癌并发抑郁症的抑郁样指征。

关键词：逍遥抗癌解郁方；乳腺癌并发抑郁症；单胺神经递质；下丘脑-垂体-肾上腺轴；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0046-06

Abstract： Objective To investigate the effects of Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula on mice with breast cancer related depression； To explore its mechanism. Methods BALB/c female mice were set as study objects. Subaxillary injection of inflammatory 4T1 cells and intraperitoneal injection of corticosterone were used to establish a model of breast cancer related depression. According to the consumption of sugar water， mice were randomly divided into blank group， model group， paclitaxel group， Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group， chemotherapy + fluoxetine group， and chemotherapy + Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group. After 21 days， sucrose preference test， open-field test， and novelty feeding test were performed to detect changes in the behavior of mice in each group. ELISA were used to detected the contents of corticotrophin releasing hormone （CRH）， adrenocorticotropic hormone （ACTH）， and corticosterone （CORT） in plasma， and the contents of 5-hydroxytryptamine （5-HT）， dopamine （DA）， norepinephrine（NE）， tumor markers carbohydrate antigen CA153， CA125 and carcinoembryonic antigen （CEA） in serum. Results Compared with the blank group， the consumption of sugar， horizontal and vertical movements of mice in the model group significantly decreased （P<0.01， P<0.05）； the latency of ingestion significantly increased （P<0.01， P<0.05）； the levels of tumor markers CA153， CA125， CEA and some indexes of HPA axis significantly increased （P<0.01）； the expressions of monoamine neurotransmitter NE， DA and 5-HT significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， sugar consumption and autonomic activity significantly increased in the chemotherapy + Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula group， and behavioral despair condition was improved （P<0.01， P<0.05）； the content of tumor markers and some indexes related to HPA axis significantly decreased （P<0.01， P<0.05）； the contents of 5-HT， DA and NE significantly increased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion The combination of Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula and paclitaxel can effectively relieve the depressive symptoms of breast cancer related depression.

Keywords： Xiaoyao Kang'ai Jieyu Formula； breast cancer related depression； monoamine neurotransmitters； HPA axis； mice

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，居我国女性恶性肿瘤之首。抑郁症作为恶性肿瘤常见的并发情感障碍类疾病，伴发几率较高，抑郁患者又会因不良情绪对疾病产生恐惧和担忧，在一定程度上加重乳腺癌病情，严重影响乳腺癌的发生、发展、治疗和转归。目前，临床上治疗乳腺癌并发抑郁症（breast cancer related with depression，BCRD）方法主要是在疾病确诊后分别进行抗肿瘤和抗抑郁治疗，起效慢，易引起恶心、呕吐、头晕头痛等不适症状，治疗效果具有一定的局限性，且由于抑郁患者的心理原因会降低患者对药物的依从性，加大治疗难度。中医药立足整体，通过多环节、多途径调节，能较好改善患者的临床症状。本实验采用具有“疏肝解郁、健脾补肾、化瘀解毒”功效的逍遥抗癌解郁方（逍遥散加减）加以干预，观察逍遥抗癌解郁方对BCRD小鼠抑郁样指征的影响，探讨其相关机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF級BALB/c雌性小鼠，4～6周龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于光暗周期为12 h/12 h、温度30 ℃、湿度50%的SPF级环境，适应性喂养5 d，自由摄食饮水。

1.2 药物

逍遥抗癌解郁方（柴胡9 g、当归9 g、姜黄9 g、贯叶连翘3 g、枸杞子9 g、菟丝子9 g、夏枯草15 g、重楼9 g、人参6 g、白花蛇舌草15 g等），饮片购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，经水煎浓缩成0.975 g原药材/mL；盐酸氟西汀片，湖南中医药大学第一附属医院，法国patheon，批号J20130010。注射用紫杉醇脂质体，规格30 mg/支，深圳万乐制药有限公司，批号201707。

1.3 主要试剂与仪器

皮质酮（CORT，索莱宝生物公司），RPMI培养基（HyClone），胰酶（HyClone），胎牛血清（四季青），DAB显色试剂盒（中杉金桥），双抗（HyClone），PBS（中杉金桥），DMSO（上海蓝润化学有限公司），二甲苯、苏木素、多聚甲醛（上海汇虹试剂有限公司），促肾上腺皮质激素（ACTH）、促肾上腺激素释放激素（CRH，R&D;公司）。多功能酶标仪（Thermo公司），光学显微镜（ZEISS）。

2 实验方法

2.1 4T1炎性乳腺癌细胞培养

4T1炎性乳腺癌原代细胞株（武汉普诺赛生物公司），显微镜下观察细胞生长状态，0.22 μm过滤器过滤细胞，弃掉培养液，离心，加入RPMI培养液（内含10%胎牛血清、1%双抗）10 mL，移至25 cm2培养瓶，置于37 ℃恒温培养箱，培养2～4 d后，观察细胞生长状态，若长至80%～90%，弃去培养液，PBS洗1次，加入胰酶消化，2 min后用移液枪轻轻吹打细胞，使80%～90%细胞消化，加入胰酶体积的含血清培养基终止消化，将细胞转移至5 mL离心管中，4 ℃、1500 r/min离心8 min，弃去培养液，PBS冲洗2次，并将细胞浓度调整为107个/mL。

2.2 乳腺癌并发抑郁动物模型制备

参考文献[1-2]方法。以Balb/c小鼠为对象，在其腋下接种107个/mL 4T1炎性乳腺癌细胞0.1 mL，接种7 d后，观察其是否成瘤，小鼠成瘤即表示乳腺癌模型成功复制。在小鼠腋下成瘤后，背部皮下注射CORT混悬液（每300 mg CORT用5 mL DMSO预溶解，超声将CORT在DMSO中充分溶解，加95 mL生理盐水）30 mg/kg，连续注射21 d，随后用行为学指标检测抑郁症模型是否建立成功，用以复制乳腺癌并发抑郁症模型小鼠。

2.3 分组

小鼠适应性喂养5 d，按糖水消耗量随机分为空白组、模型组、紫杉醇组、逍遥抗癌解郁方组、化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组，每组10只。

2.4 给药

化疗各组予注射用紫杉醇脂质体（制成1 mg/mL混合液）腹腔注射，每周1次，给药体积为20 mL/kg；氟西汀（制成0.13 mg/mL的混悬液，4 ℃低温保存备用）给药体积为19.5 mL/kg；逍遥抗癌解郁方给药体积为20 mL/kg；空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。每日1次，连续3周。所有药物给药剂量均按人体质量等效剂量计算。

2.5 指标检测

2.5.1 行为学检测

2.5.1.1 糖水偏好实验

糖水偏好度反应抑郁动物快感缺失症状。将小鼠饲养于单笼内，禁食禁水12 h后，给予事先称好质量1%蔗糖水和蒸馏水各1瓶，1 h后取出水瓶，称量剩余的蔗糖水与蒸馏水的质量。糖水消耗总共测量4次，时间分别为抑郁造模前和造模后1、2、3周。糖水偏好度（%）=糖水消耗量÷（蒸馏水消耗量+糖水消耗量）×100%。

2.5.1.2 Open-field实验

小鼠禁食不禁水24 h，将动物放入箱中心，实验箱规格为50 cm×50 cm×40 cm。适应30 s后，观察并记录动物在3 min内双后肢跨越方格的个数（水平运动）与前肢腾空或攀爬墙壁的次数（垂直运动）。实验在无明显光源的环境中进行，观察完毕擦拭箱内壁及底面，以免动物余留信息影响下次测试结果。

2.5.1.3 新奇摄食实验

小鼠禁食不禁水24 h，将动物面向箱壁从同一位置放入试验箱，实验箱规格为50 cm×50 cm×40 cm，箱中心放入适量等体积食物，适应30 s后，观察并记录小鼠5 min内首次咀嚼食物的时间。实验在无明显光源的环境中进行，观察完毕擦拭箱内壁及底面，以免动物余留信息影响下次测试结果。

2.5.2 血液学指标检测

行为学检测完成后，小鼠禁食禁水24 h，摘眼球取血。左手捏住小鼠耳后皮毛，使眼球突出，右手持镊子将眼球迅速摘除，用含或不含肝素钠的EP管接住从眼眶中滴出的血液。4 ℃静置2 h，3000 r/min离心10 min，取上清液，置于液氮中速凍，后转移至超低温保存箱备用。将保存备用的血清或血浆样本室温下解冻，严格按ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中单胺类神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）的含量，血浆中CORT、CRH、ACTH及肿瘤标志物糖类抗原CA153、CA125和癌胚抗原（CEA）的含量。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett's T3进行两两比较。检验水准α=0.05。

4 结果

4.1 行为学变化

4.1.1 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠糖水偏好度的影响

与空白组比较，造模前和造模第1周模型小鼠糖水偏好度比较差异无统计学意义（P>0.05），造模第2、3周模型组糖水偏好度明显下降，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），且随造模时间延长，糖水偏好度下降更明显；与模型组比较，造模第2周化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组糖水偏好度明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。造模第3周化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组、逍遥抗癌解郁方组糖水偏好度明显上升，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），尤以化疗+联合逍遥抗癌解郁方组效果最明显。结果见表1。

4.1.2 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠自主行为的影响

与空白组比较，模型组小鼠水平运动、垂直运动次数明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组水平运动、垂直运动次数明显增加，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），化疗组、逍遥抗癌解郁方组对小鼠自主活动有一定的影响，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

4.1.3 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠新奇摄食潜伏期的影响

与空白组比较，模型组小鼠摄食潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组小鼠摄食潜伏期显著缩短，差异有统计学意义（P<0.05），化疗组、逍遥抗癌解郁方组可缩短小鼠摄食潜伏期，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

4.2 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠血浆肿瘤标志物含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血浆肿瘤标志物CA153、CA125和CEA明显上升（P<0.01）；与模型组比较，化疗组、化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组小鼠血浆肿瘤标志物CA153、CA125和CEA明显下降（P<0.01，P<0.05）。结果见表4。

4.3 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠血清单胺类神经递质含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清单胺类神经递NE、DA和5-HT均明显下降（P<0.01）；与模型组比较，化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组小鼠血清单胺类神经递质NE、DA和5-HT均明显上升（P<0.01，P<0.05）。结果见表5。

4.4 逍遥抗癌解郁方对模型小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴相关指标的影响

与空白组比较，模型组小鼠血浆CORT、ACTH、CRH均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.01）；与模型组比较，逍遥抗癌解郁方组、化疗+氟西汀组、化疗+逍遥抗癌解郁方组小鼠血浆CORT、ACTH和CRH均明显下降，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结果见表6。

5 讨论

心理状况影响乳腺患者的生活质量，也预示着患者预后的好坏。研究发现，乳腺癌患者中63.5%伴发抑郁症，其中17.3%为重度抑郁[3]。

血清肿瘤标志物检测具有简便、快捷等优势，对乳腺癌的发生、发展、治疗及预后具有重要的临床意义。血清CEA、CA153、CA125是乳腺癌临床诊断应用广泛的一类肿瘤标志物[4]。本实验结果表明，逍遥抗癌解郁方可较好辅助化疗药的功效，即降低BCRD小鼠肿瘤标志物CA153、CA125和CEA的表达。

抑郁模型动物行为学评价在某种程度可重现抑郁患者行为学的特征。自主探究活动下降及紧张度增高是抑郁症的重要表征，新奇摄食实验潜伏期是观察研究实验动物神经精神变化，评价实验动物在新奇环境中自主行为、探究行为与紧张度的一个重要参数；快感缺失是抑郁症的核心症状，在动物研究方面主要是以糖水偏好的程度作为参考指标。本实验研究结果表明，BCRD小鼠存在快感缺乏症状等典型的抑郁样症状，而化疗药物联合逍遥抗癌解郁方可提高BCRD小鼠对快感的反应度，增加模型小鼠新奇环境中的自主行为、探索与摄食欲望，逆转BCRD小鼠抑郁样精神状态。

“单胺假说”是目前公认的抑郁症发病的病理基础，该假说认为抑郁症的发病与中枢神经单胺类神经递质5-HT、NE、DA的耗竭紧密相关[5]。研究表明，5-HT、NE、DA耗竭剂能使抑郁症状加剧，而其降低程度与抑郁症的严重程度呈正相关[6]。因而，增加大脑单胺类神经递质水平是治疗抑郁症的重要途径之一。目前临床上主要以5-HT、NE重吸收抑制剂作为抑郁症治疗的首选药物，此类药物可通过阻断5-HT或NE重吸收，提升其在突触间隙的浓度，进而有效缓解病情[7]。本研究结果表明，化疗联合逍遥抗癌解郁方可显著升高BCRD小鼠血液中单胺类神经递质NE、DA和5-HT的表达，可能以此达到其抗抑郁的功效。

抑郁症属应激性疾病，其发生与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的亢进密切相关[8]，HPA轴作为大脑应激应答的重要机制之一，在抑郁症的病因、病理学机制中起关键作用。当HPA轴长期处于亢进状态，可导致神经内分泌异常和抑郁样行为的发生[9]。心理应激主要通过以HPA轴为中心的网络来影响大脑某些区域，如蓝斑、海马等，故而乳腺癌并发抑郁症作为一种复杂的慢性心理应激状态，必然与HPA轴紧密相关[10]。急、慢性应激事件可促使下丘脑分泌 CRH，CRH刺激脑垂体分泌ACTH，ACTH刺激肾上腺皮质释放CORT。CORT是HPA轴重要激素之一，可调节人体的代谢、认知功能和情绪等，尤其对恐惧和焦虑情绪作用明显[11]。本研究结果表明，逍遥抗癌解郁方可明显地降低BCRD小鼠血浆CORT、ACTH和CRH的表达，化疗药物联合逍遥抗癌解郁方可逆转HPA轴的功能亢进。

逍遙抗癌解郁方由《太平惠民和剂局方》之逍遥散加减而成，方用枸杞子、菟丝子补肾益精，夏枯草、重楼化瘀解毒，姜黄活血化瘀、行气止痛，善破肝脾二经之血瘀气结，主血瘀气滞诸证，贯叶连翘疏肝解郁，人参安神益智。本研究结果表明，逍遥抗癌解郁方与化疗药物联用可明显缓解乳腺癌并发抑郁症的抑郁样症状，并能有效辅助化疗药物延缓乳腺癌并发抑郁症的发展。

参考文献：

[1] YAN L， LI L， HAO F， et al. Establishment of mice breast cancer model in BALB/c mice with 4T1 cells[J]. Chinese Journal of Immunology，2014，30（6）：794-796.

[2] GUPTA D， RADHAKRISHNAN M， KURHE Y. Effect of a novel 5-HT3 receptor antagonist 4i， in corticosterone-induced depression- like behavior and oxidative stress in mice[J]. Steroids，2015， 96（11）：95-102.

[3] PARK E M， GELBER S， ROSENBERG S M， et al. Anxiety and depression in young women with metastatic breast cancer：a cross-sectional study[J]. Psychosomatics，2018，59（3）：251-258.

[4] 皮亚平，田柳.肿瘤标志物CA153、CA125联合检查对乳腺癌诊断的价值分析[J].实用癌症杂志，2017，32（8）：1351-1353.

[5] HAMANER M B，DIAMOND B I. Plasma dopamine and norepinephine correlation with psychomotor retardation， anxiety， and depression in nonpsychotic depressed patients：a pilot study[J]. Psychiatry Res，1996，64：209.

[6] HARMER C J， DUMAN R S， COWEN P J. How do antidepressants work？ New perspectives for refining future treatment approaches[J]. Lancet Psychiatry，2017，4（5）：409-418.

[7] FINBERG J P. Update on the pharmacology of selective inhibitors of MAO-A and MAO-B：focus on modulation of CNS monoamine neurotransmitter release[J]. Pharmacol Ther，2014，143（2）：133-152.

[8] KANG H J， BAE K Y， KIM S W， et al. Longitudinal associations between glucocorticoid receptor methylation and late-life depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2018， 84（Pt A）：56-62.

[9] BLOCK T S， KUHNER H， KALIN N， et al. Combined analysis of mifepristone for psychotic depression：llasma levels associated with clinical response[J]. Biol Psychiatry，2018，84（1）：30035- 30040.

[10] PARIANTE C M，LIGHTMAN S L. The HPA axis in major depression ：classical theories and new developments[J]. Trends Neurosci， 2008，31（9）：464-484.

[11] WEGER M， SANDI C. High anxiety trait：A vulnerable phenotype for stress induced depression[J]. Neurosci Biobehav Rev，2018，87：27-37.