胡鲜梅 李长松 曹亚栋 徐作珽 张悦丽 齐军山 马立国张 博 孙明伟 芮法富

（1山东省农业科学院植物保护研究所，山东省植物病毒学重点实验室，山东济南 250100；2山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271001；3济南阿波罗甲壳素肥业有限公司，山东济南 250101）

生姜茎基腐病病原鉴定及甲壳胺对其病原菌的抑菌作用

胡鲜梅1，2李长松1*曹亚栋1徐作珽1张悦丽1齐军山1马立国1张 博1孙明伟3芮法富3

（1山东省农业科学院植物保护研究所，山东省植物病毒学重点实验室，山东济南 250100；2山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271001；3济南阿波罗甲壳素肥业有限公司，山东济南 250101）

通过形态学观察、致病性测定及序列分析，对生姜茎基腐病病原菌进行鉴定；并采用菌丝生长速率法、活体组织法和田间试验研究甲壳胺对生姜茎基腐病病原菌的抑菌活性。结果表明，生姜茎基腐病病原菌为群结腐霉（Pythium myriotylum）、刺腐霉（Pythium spinosum）和林栖腐霉（Pythium sylvaticum）。甲壳胺对3种腐霉菌均有抑制作用，抑制中浓度（EC50）分别为422.711 2、401.699 5、446.910 7 μg·mL-1。显微观察显示，甲壳胺处理后的腐霉菌丝膨大、扭曲，分枝增多，菌丝内部出现空泡化。活体组织法试验结果表明，甲壳胺可以明显抑制生姜茎基腐病的发生。田间防治试验结果表明，甲壳胺可以明显预防生姜茎基腐病的发生，从而提高生姜产量。

生姜；茎基腐病；形态特征；序列分析；甲壳胺；抑菌活性

山东省生姜栽培由来已久，近年来随着生姜种植面积的不断扩大，病害发生也呈上升趋势，尤其是生姜茎基腐病的发生十分严重，给姜农带来巨大的经济损失，已成为生姜生产中的主要病害之一。

1907年Butler首次报道绚丽腐霉（Pythium gracile）侵染可引起生姜茎基腐病的发生（Butler，1907）。截至目前，已发现的能引起生姜茎基腐病的腐霉病原菌有10余种，而关于该病的病原菌，国内外报道不尽一致。由于地理环境及气候的差异，导致不同国家及地区间病原菌优势种类有较大差异（元菊丹，2011）。如瓜果腐霉（P.aphanidermatum）、巴特勒腐霉（P. butleri）、完整腐霉（P. complectens）、终极腐霉（P. ultimum）、群结腐霉（P. myriotylum）、钟器腐霉（P. vexans）、禾生腐霉（P. graminicola）、刺腐霉（P. spinosum）和德里腐霉（P. deliense）等都可在国外不同国家和地区引起生姜茎基腐病的发生。国内生姜茎基腐病病原菌有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、喙腐霉（P. rostratum Butler.）、周雄腐霉（P. periilum Drechsler）、群结腐霉（P. myriotylum）、禾生腐霉（P.graminicola）和腐霉（P. monospermum）等（姜子德和戚佩坤，1992；李林 等，2009）。

生姜茎基腐病是典型的土传病害和种子传播病害，其无性繁殖体游动孢子可随水流在土壤中传播，与生姜根系或茎基接触后侵入组织致其发病，而后迅速向上扩展蔓延，引起叶片黄化、叶枯乃至植株枯死。寄主发病后，在发病部位表面能产生大量孢子囊和游动孢子，可以进行多次再侵染（Ichitanit & Shinsu，1980；Davis，1991；Ravindren & Nirmal，2005）。目前防治茎基腐病的方法主要是化学防治，但是从环境安全和人类健康角度考虑，急需寻找安全有效的生物防治方法和途径（Stirling，2009；Pandey，2010）。

甲壳胺，又名壳聚糖、脱乙酰甲壳质、可溶性甲壳质、几丁聚糖、脱乙酰几丁质、聚氨基葡糖，是一种天然多糖类高分子化合物，在自然界中广泛存在。由于其生物相容性、无毒性、抗菌性、可生物降解等优点，近年来在农业上的应用日趋广泛（李牧，2007）。前人研究表明，甲壳胺对番茄叶霉病菌的孢子萌发和菌丝体生长均具有明显抑制作用（李美芹，2007）；随着浓度的提高，甲壳胺对樱桃番茄腐败菌的抑制作用增强（马菲，2013）；甲壳胺作为激发子，可有效诱导植物抗病性，增强植物对病害的防御能力（许珍，2012）。本试验通过形态学观察、致病性测定及序列分析，对生姜茎基腐病病原菌进行鉴定；并采用菌丝生长速率法、活体组织法和田间试验研究甲壳胺对生姜茎基腐病病原菌的抑菌活性，旨在为防治生姜茎基腐病和绿色药剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种（Pythium myriotylum、Pythium spinosum、Pythium sylvaticum）分离于2015年安丘明显感染茎基腐病的生姜姜块上。

供试培养基：水琼脂培养基（WA：100 mL无菌水中加入1 g琼脂）；马铃薯琼脂培养基（PDA：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、无菌水1 000 mL）；CMA培养基（玉米粒60 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）；玉米粒VP3培养基（Ali-Shtayeh et al.，1986）；皮氏液〔Ca（NO3）20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg（NO3）20.15 g，CaCl20.06 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃蒸汽灭菌15～20 min〕。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离及显微镜观察 将采集的带病姜块用水冲洗干净，用消毒医用手术刀将发病姜块病健交界处切成小块，放入纱袋中，用流水冲洗12 h，取出组织小块，用灭菌滤纸吸干表面水分后，置于WA培养基上，于25 ℃培养箱中培养，待长出新鲜菌丝及时用菌丝顶端分离技术分离数代后，得到单一菌种。

将得到的单一菌种置于CMA平板上，25 ℃黑暗条件下培养48 h，挑取边缘菌丝块转入皮氏液，放置于25 ℃培养箱诱发培养。每隔1 h挑取菌丝在显微镜下对孢子囊、卵孢子、藏卵器及雄器进行观察并照相。测量成熟的孢子囊、雄器、藏卵器及卵孢子大小。每项指标分别观察测量200个，并计算其平均值（刘振伟和史秀娟，2009）。

根据余永年（1998）主编的《中国真菌志》（第六卷·霜霉目）的检索表及描述，对菌丝体、孢子囊、雄器、藏卵器及卵孢子的形态特征、有关特性以及菌落形态等进行鉴定。

1.2.2 致病性测定 将玉米粒煮熟灭菌，在无菌操作台中接种病原菌，25 ℃培养48 h，灭菌玉米粒长满待测病原菌。将每1 kg灭菌土与50 g带菌玉米粒混匀，对照用不接菌的玉米粒与灭菌土混匀，分别种入健康的姜块。适时浇水，保持一定的土壤湿度。接种60 d后调查、记录发病症状。

1.2.3 致病菌测序鉴定 用灭菌的解剖刀刮取PDA平板上的菌丝，放入研钵中，加入液氮迅速研磨。采用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）提取供试菌株的DNA，用特异性引物ITS1和ITS4扩增，将扩增条带经过测序得到的rDNA-ITS序列与GenBank中已有的相关菌株的ITS序列进行同源比对。利用MEGA 5.2等相关生物学软件进行序列比对，分析同源性，并构建系统发育树。

1.2.4 不同浓度甲壳胺的抑菌试验 采用菌丝生长速率法测定甲壳胺对病原真菌腐霉菌的抑菌活性。将甲壳胺加入到45 mL灭菌PDA中配成不同浓度的培养基，摇匀、冷却、接种。在25 ℃条件下培养并逐日观察病原菌的生长情况。以不加药剂为对照。待对照组菌落几近长满平板时，测量各处理菌落直径，计算菌丝生长抑制率。将各自数据分别带入DPS数据处理系统，得到EC50值。

1.2.5 甲壳胺对腐霉菌菌丝形态的影响 从培养2 d的腐霉菌菌落边缘打取5 mm的试菌饼，接种于100 mL含0.4 mg·mL-1甲壳胺的液体PDA培养基的三角瓶中，每瓶接5块，每处理3次重复，以不含甲壳胺的PDA培养基为对照。于25 ℃、120 r·min-1振荡培养48 h，挑取菌丝体，显微镜观察并照相。

1.2.6 田间防治试验 田间试验于2016年在安丘市景芝镇孙家沙浯村进行，该地区2015年生姜茎基腐病发病率85%，几乎绝产。试验设3个处理：T1，每667 m2施棉隆30 kg，熏蒸25 d，揭膜翻晾10 d，旋耕前每667 m2施甲壳胺有机肥（济南阿波罗公司，有机质＞45%，下同）200 kg作底肥，种前沟施有机肥100 kg，摆好姜种喷施养根素（甲壳胺60 g·L-1）1 L，之后分别于第1次、第2次浇水、小培土、大培土时施养根素1 L。小培土、大培土时分别施甲壳胺有机肥（济南阿波罗公司）120 kg和80 kg。T2处理根据当地生物菌肥常用施肥方法，每667 m2施棉隆30 kg，熏蒸25 d，揭膜翻晾10 d，旋耕前施微生物菌剂凯迪瑞（含枯草芽孢杆菌2亿个·g-1）160 kg作底肥。种前沟施微生物菌剂凯迪瑞80 kg、微生物菌扩培剂（宝地生-扬州博轩生物技术有限公司）4.8 kg。对照（CK）按照当地施肥习惯，每667 m2旋耕前施土杂肥3 m3、生物有机肥（益生元-京青中信科技有限公司）100 kg，种前沟施生物有机肥（益生元-京青中信科技有限公司）100 kg、0.5%阿维菌素颗粒剂1.2 kg以防治线虫病害。2016年4月10日播种，小区面积50 m2，4次重复，顺序排列。

收获前调查生姜茎基腐病发病情况，每小区80株，计算病情指数和防治效果。生姜茎基腐病分级标准：0级，无症状；1级，1%～25%叶片有发病症状；2级，26%～50%叶片有发病症状；3级，51%～75%叶片有发病症状；4级，76%以上的植株倒伏、枯死。10月10日收获，每小区收获生姜6 m2，测产量。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征

群结腐霉菌落在CMA培养基上无特定形态。菌丝发达，分枝，粗3.1～7.0 μm，平均为4.5 μm。孢子囊由膨大与不膨大菌丝共同组成，膨大部分呈指状或裂瓣状，顶生或间生，平均为216 μm×15 μm。藏卵器球形或近球形，平滑，顶生或间生，偶有2个串生，直径20～31 μm，平均为25.2 μm。雄器棒状或钩状，着生于分枝的雄器柄顶端，与藏卵器异丝生，以顶端与藏卵器接触（图1）。

林栖腐霉菌落在CMA培养基上呈放射状，有气生菌丝产生。菌丝较粗，直径3.5～10.5μm。菌丝膨大体形态多样，球形、柠檬形，间生或顶生，球形菌丝膨大体直径为18.7～24.2 μm，平均为19.7 μm；柠檬形菌丝膨大体平均为17.9 μm×23.3 μm，不产生游动孢子。藏卵器光滑，多数间生。雄器异丝生，在接近藏卵器处形成二叉分枝。卵孢子不满器（图2）。

图1 群结腐霉（Pythium myriotylum）的形态特征

图2 林栖腐霉（Pythium sylvaticum）的形态特征

刺腐霉菌落在CMA培养基上呈放射状。菌丝无隔，老熟菌丝有隔，发达，不规则分枝，菌丝粗4.1～7.3 μm。菌丝膨大体球形，顶生，间生或切生，顶生时偶见生于主干菌丝的短小分枝上，直径10～32 μm，平均为18.7 μm，萌发产生芽管。藏卵器球形，间生或顶生，偶有切生，直径13～25 μm，平均为19.2 μm。藏卵器上均匀分布指状突起，突起物绝大多数直立，较少弯曲。雄器棍棒状或弯棍棒状，顶生，与藏卵器同丝生，较少异丝生，罕无柄，每个藏卵器有1～3个雄器。卵孢子球形，平滑，满器，偶有不满器的，直径12～22 μm，平均为17.3 μm；壁厚0.9～1.7 μm，平均为1.49 μm，内含贮物球和折光体各1个（图3）。

图3 刺腐霉（Pythium spinosum）的形态特征

2.2 致病性测定

致病性测定结果表明，群结腐霉、刺腐霉、林栖腐霉对生姜均具有致病性。接种1个月后，生姜茎基部接种点周围呈水渍状，维管束变褐，茎基部缢缩，甚至倒伏，叶片发黄萎蔫，与田间自然发病植株症状类似。从根、茎基部病组织上重新分离的病原菌与田间植株上分离的病原菌的菌落、孢子囊、藏卵器等形态完全一致，结果符合Koch法则。

2.3 序列分析

将测序得到的rDNA-ITS序列与GenBank中已有的相关菌株的ITS序列进行同源比对，结果表明，分离到的菌株Q、C、L分别与群结腐霉（P.myriotylum）、刺腐霉（P. spinosum）、林栖腐霉（P.sylvaticum）的相似性最高，同源性可达100%。

从GenBank中下载不同种的腐霉菌ITS序列，采用MEGA软件以Neighbor-Joining计算法，构建基于ITS序列的系统发育树（图4）。从系统发育树可以看出，C、L、Q分别与P. spinosum、P. sylvaticum、P. myriotylum在同一分枝上，同源关系较近。结合形态分析，可知C、L、Q分别为刺腐霉（P.spinosum）、林栖腐霉（P. sylvaticum）、群结腐霉（P.myriotylum）。

2.4 甲壳胺对3种腐霉菌的抑制作用

试验结果表明（表1），甲壳胺对3种腐霉菌的抑制中浓度均在400～500 μg·mL-1之间，抑菌效果明显。

2.5 甲壳胺对腐霉菌丝形态的影响

显微照相观察显示，甲壳胺处理后的菌丝膨大、扭曲，分枝增多，菌丝内部出现空泡化（图5），与Benhamou（1992）的描述一致。

图4 基于ITS序列构建的腐霉菌系统发育进化树

表1 甲壳胺对3种腐霉菌的抑制作用

2.6 田间防治试验

从表2可以看出，T1（甲壳胺处理）对生姜茎基腐病的防治效果可达到98.02%，比对照增产51.14%；与T2处理相比，防治效果提高了3.23个百分点，产量增加了35.33%。表明甲壳胺可以预防生姜茎基腐病的发生，进而提高产量，而且对环境友好，有较高的投产使用优势。

图5 甲壳胺对腐霉菌丝形态的影响（400×）

表2 安丘市景芝镇生姜茎基腐病防治试验

3 结论与讨论

甲壳胺是一种天然多糖类高分子化合物，在自然界中广泛存在，由于天然无毒、环境友好的特性，使得其在农业、医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。余雄伟（2011）研究发现，甲壳胺对细菌细胞膜的通透性有破坏作用，细菌核内物质渗漏，最终导致菌体死亡。王云光（2015）研究发现，低分子量的甲壳胺可降低真菌菌丝内麦角固醇的含量，并通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性，进入细胞内部对细胞器造成破坏，导致细胞内容物的流失。荆迎军等（2006）研究了10个分子量的甲壳胺对6种细菌的抑菌性，结果表明，甲壳胺的抑菌机理有可能是影响细胞膜的透性。

本试验鉴定得到3种生姜茎基腐病病原菌：群结腐霉（Pythium myriotylum）、刺腐霉（Pythium spinosum）和林栖腐霉（Pythium sylvaticum）。通过室内菌丝生长抑制法和室外田间试验测定了甲壳胺对腐霉菌的抑制作用，结果表明甲壳胺可使菌丝肿胀变形、分枝增多、菌丝内部出现空泡化，与前人的研究结果一致，但是甲壳胺对腐霉菌丝形态的影响机理还不够完善，需做进一步研究。田间试验中通过施用含甲壳胺的有机肥作基肥和追肥，同时在种植、浇水和培土时沟施甲壳胺表现出较好的防病增产效果，证明田间通过土壤熏蒸处理结合施用甲壳胺或微生物制剂，可以较好地控制生姜茎基腐病。本试验还对安丘和昌邑的生姜茎基腐病地块进行土壤含菌量测定，不发病地块每克土壤含菌量为10～100个，重病地块每克土壤含菌量为800～2 500个。表明腐霉菌含量越高，生姜茎基腐病发病就越重。甲壳胺对田间生姜茎基腐病的预防增产结果可能与甲壳胺抑制土壤中腐霉的含量有关。

综上可知，新型生物农药甲壳胺具有高效的抑菌效果，可有效减少生姜茎基腐病的发生，是防治生姜茎基腐病的优秀生物替代制剂，具有良好的开发前景和工业生产潜力。

姜子德，戚佩坤．1992．腐霉对姜根茎腐烂的作用．华南农业大学学报，（4）：97-101．

荆迎军，郝友进，渠晖，单颖，李德森，杜荣骞．2006．壳聚糖的抑菌活性分析及其抑菌机理的研究．中国抗生素杂志，（6）：361-365．

李林，李长松，徐作珽，齐军山，李凡．2009．生姜根茎腐病的发生与防治．中国蔬菜，（15）：22-24．

李美芹．2007．壳聚糖抑制番茄叶霉病菌的活性与诱导抗性及其机理研究〔博士论文〕．青岛：中国海洋大学．

李牧．2007．壳聚糖的性质及应用研究．科技信息：科学教研，（20）：52-53．

刘振伟，史秀娟．2009．莱芜生姜茎腐病的病原鉴定．中国植保导刊，29（7）：9-11．

马菲．2013．樱桃番茄壳聚糖涂膜效果及改进研究〔硕士论文〕．北京：中国农业科学院．

王云光．2015．低分子量的壳聚糖的抗真菌活性及水果保鲜作用〔硕士论文〕．武汉：华中农业大学．

许珍．2012．壳寡糖新型生物农药的研制及应用研究〔硕士论文〕．武汉：华中农业大学．

余雄伟．2011．壳聚糖抑菌机理研究〔硕士论文〕．武汉：武汉工业学院．

余永年．1998．中国真菌志（第六卷·霜霉目）．北京：科学出版社：1-139．

元菊丹．2011．山东生姜茎基腐病病原鉴定及防治研究〔硕士论文〕．曲阜：曲阜师范大学．

Ali-Shtayeh M S，Len L H C，Dick M W．1986．An improved method and medium for quantitative estimates of populations of Pythium species from soil．Transactions of the British Mycological Society，86（1）：39-47．

Benhamou N．1992．Ultrastructural and cytochemical aspects of chitosan on Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici，agent of tomato crown and root rot．Phytopathology，82：1185-1193．

Butler E J．1907．An account of the genus Pythium and some Chytridiaceae．Mem Dep Agric India Bot Ser，1：1-162．

Davis J R．1991．Soil Solarisation．Boca Raton：CRC Press：23-27．

Ichitanit T，Shinsu T．1980．Pythium zingiberum causing rhizome rot of ginger plant and its distribution．Ann Phytopathol Soc Jpn，46（4）：435-441．

Pandey A K，Awasthi L P，Srivastva J P，Sharma N K．2010．Management of ginger（Zingiber officinale Rosc）rhizome rot in Darjeeling and Sikkim Himalayan region．J Phytol，2（9）：18-20．

Ravindren P N，Nirmal B．2005．Ginger：The Genus Zingiber．Boca Raton：CRC Press：308-316．

Stirling G R，Turaganivalu U，Stirling A M，Lomavatu M F，Smith M K．2009．Rhizome rot of ginger（Zingiber officinale）caused by Pythium myriotylum in Fiji and Australia．Australasian Plant Pathology，38（5）：453-460．

Identification of Rhizome Rot Disease Pathogen in Ginger and Chitosan Antifungal Effect on Pathogen

HU Xian-mei1，2，LI Chang-song1*，CAO Ya-dong1，XU Zuo-ting1，ZHANG Yue-li1，QI Jun-shan1，MA Li-guo1，ZHANG Bo1，SUN Ming-wei3，RUI Fa-fu3
（1Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Plant Virology of Shandong Province，Jinan 250100，Shandong，China；2Plant Protection College，Shandong Agricultural University，Tai’an 271001，Shandong，China；3Jinan Apollo Chitosan Fertilizer Industry Co. LTD，Jinan 250101，Shandong，China）

This paper carried out identification on pathogen of rhizome rot disease in ginger by morphological observation，pathogenicity test and sequence analysis；and studied the antifungal activity of chitosan against ginger rhizome rot disease by mycelium growth rate method，in vivo biospy and field experiment. The results showed that the pathogen of ginger rot disease was identified as Pythium myriotylum，Pythium spinosum and Pythium sylvaticum，the mycelial growth of those pathogens were restrained by chitosan and the EC50values were 422.711 2，401.699 5，446.910 7 μg·mL-1，respectively. Micrography observation showed，while inoculated in the substrate with chitosan，the mycelia would abnormally grow，like：bulging，contorting，having more branches，and vacuolation appearing inside of mycelia. These results showed that chitosan could obviously inhibit the occurrence of rhizome rot disease in ginger. The results of field control experiment showed that chitosan could significantly prevent the occurrence of rhizome rot disease in ginger，and consequently improve the ginger yield.

Ginger；Rhizome rot disease；Morphological characteristics；Sequence analysis；Chitosan；Antifungal activity

胡鲜梅，女，硕士研究生，主要从事蔬菜病害研究，E-mail：xianmeihu@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：李长松，研究员，硕士生导师，主要从事植物病害与防治研究，E-mail：lics1011@sina.com

2017-04-26；接受日期：2017-06-23

国家重点研发计划项目（2017YFD0201605），山东省农业重大应用技术创新项目，山东省农业科学院重大科技创新项目（2014CXZ07），山东省农机装备研发创新计划项目