李冀，卞亚男，高彦宇，武斌

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

HPLC法同时测定乌腺金丝桃中三种黄酮类化合物的含量

李冀，卞亚男，高彦宇，武斌*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:利用高效液相色谱法同时测定乌腺金丝桃中芦丁、槲皮素、山萘酚的含量。方法: 采用Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水(v/v)；梯度洗脱，流速 1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长360 nm。结果：在18 min内，乌腺金丝桃中上述3个成分完全分离，芦丁，槲皮素，山萘酚分别在20.0～80.0 μg/mL，25.0～80.0 μg/mL，14.0～80.0 μg/mL的范围内线性关系良好(r值分别为0.999 0，0.999 2，0.999 2)；平均加样回收率(n=6)分别为97.88%(RSD=1.16%)、96.57%(RSD=1.89%)、97.68%(RSD=2.56%)。样品中化合物1～3的含量平均值分别为0.02、0.03、0.01 mg/g。结论：该方法简单、快速、结果可靠，可用于同时测定乌腺金丝桃中化合物1～3的含量。

乌腺金丝桃；高效液相色谱；芦丁；槲皮素；山萘酚

乌腺金丝桃(Hypericumattenuatumchoisy)为滕黄科(Clusiaceae)金丝桃属植物(Hypericum)。民间以干燥全草入药，具有止血、镇痛、通乳等功效，主要适用于咯血，吐血，子宫出血，神经痛，风湿关节痛，跌打损伤，乳汁缺乏，乳腺炎。乌腺金丝桃的中黄酮类化合物因其具有多方面的生物活性而成为研究热点[1]。通过对产自甘肃宕昌的乌腺金丝桃黄酮类化学成分分离提取，董建勇等[2]得到了11个黄酮化合物。其中闫东对乌腺金丝桃正丁醇萃取物研究发现，其对乌头碱和氯化钙两种途径诱发的快速型心律失常动物模型具有明显拮抗作用，其中抗心律失常生物活性最显著的是金丝桃苷[3]。通过对乌腺金丝桃中4种黄酮类化合物对PC12细胞DNA氧化应激损伤的研究，表明4种乌腺金丝桃黄酮化合物均对H2O2导致的细胞氧化损伤均具有防护作用[4]。徐颖等对金丝桃苷研究发现，其能抑制阿霉素所致的心肌细胞损伤,对缺氧再给氧损伤也有保护作用[5]。张杰等、窦志强等对乌腺金丝桃黄酮类化合物研究，发现其可抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖[6-7]。

本文利用高效液相色谱仪，同时测定乌腺金丝桃中芦丁、槲皮素、山萘酚三种化合物的含量，可为乌腺金丝桃的质量标准提供依据。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、Waters 2998检测器、柱温箱)；色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；AL 204分析天平( 上海梅特勒公司 )；超声波清洗器SK5200HP型(上海科导超声仪器有限公司)。流动相乙腈为色谱纯(美国Dikama公司)；其余试剂均为分析纯。

乌腺金丝桃(Hypericumattenuatumchoisy)由吉林农业科技学院提供。芦丁，中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-16111112；槲皮素，中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-16111114；山萘酚，中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-16032801。标准品经HPLC检测纯度均≥98%。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备

精密称取各对照品5.0 mg，加甲醇配置定容到50 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

精密称取5.0 g乌腺金丝桃，加25 mL甲醇溶解30 min，超声30 min，去滤渣挥干，用乙酸乙酯复溶，水洗3次，分液漏斗静置分层，去掉水层，乙酸乙酯蒸干，加入甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

采用Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相 A为乙腈，B为0.1% (v/v)磷酸水；梯度洗脱程序:0 min，25% A，18 min，45% A，流速1.0 mL/min；柱温箱温度30 ℃，流速1.0 L/min，检测波长360 nm，进样量10 μL。HPLC色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液 0.1、1、2、4、6、8 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容。按“2.3”项下色谱条件测定，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。芦丁、槲皮素、山奈酚的回归方程分别为Y=16 047X-76 900(r=0.999 0)，线性范围20.0～80.0 μg/mL；Y=38 396X-156 676(r=0.999 2)，线性范围25.0～80.0 μg/mL；Y=38 822X-163 421(r=0.999 2)，线性范围14.0～80.0 μg/mL。

图1 样品(A)、混合对照品(B)的HPLC色谱图

2.5 精密度考察

取混合对照品溶液，按照色谱条件连续进样6次，测定芦丁、槲皮素、山奈酚的峰面积RSD分别为0.36%、0.56%、1.1%，实验结果表明该仪器精密度良好。

2.6 重复性考察

精密称取乌腺金丝桃药材6份，每份5.0 g，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件进样测定，测得样品中芦丁、槲皮素、山奈酚的RSD分别为1.1%、1.8%、2.5%，均小于3%，实验结果表明该方法重复性好。

2.7 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h注入液相色谱仪，按照色谱条件进行测定，芦丁、槲皮素、山奈酚的峰面积RSD分别为0.92%、0.89%、0.98%，实验结果表明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率考察

精密称取已测定的样品6份，5.0 g/份，分别精密加入等量的芦丁、槲皮素、山奈酚的对照品溶液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件测定，计算加样回收率。结果芦丁、槲皮素、山奈酚的平均回收率分别为97.88%(RSD=1.16%)、98.68%(RSD=2.56%)、96.57%(RSD=1.89%)。实验结果表明该提取方法准确度良好。

2.9 含量测定

按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件进行测定，代入回归方程，计算芦丁、槲皮素、山奈酚的含量。测定结果见表1。

表1 芦丁、槲皮素、山奈酚在乌腺金丝桃中的含量(mg/g，n=3)

3 讨论

3.1 流动相的选择

本文考察了不同的流动相：甲醇-水，甲醇-磷酸水，乙腈-水，乙腈-磷酸水，还曾探讨过磷酸水中磷酸的含量0.1%、0.2%、0.3%，其中以甲醇-水作为流动相，峰型较差，分离度不高；乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，峰型最佳，分离度高。最终本实验确定为乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，杂质干扰小，专属性高。

3.2 柱温、分析时间及波长的选择

应用Empower软件，分析乌腺金丝桃的3D谱图，发现芦丁、槲皮素、山萘酚分别在358 nm、360 nm、370 nm处有最大吸收，所以将波长设定为360 nm。柱温考察25 ℃、30 ℃、35 ℃，结果显示柱温为30 ℃时峰型较好。检测时间在18 min，对芦丁，槲皮素，山萘酚的所得峰型对称、分离度>1.5。

乌腺金丝桃中黄酮类含量较高，其中黄酮类化合物中，这三种化合物含量较高，对其黄酮类的药理活性深入研究可为乌腺金丝桃的血清药化学研究提供依据。

[1] 张兆洲,戴恩来,付雪,等.乌腺金丝桃的化学成分及药理作用研究进展[J].甘肃中医药学报,2015,32(4):72-75.

[2] 董建勇,贾忠建.赶山鞭中黄酮类化学成分研究[J].中国药学杂志,2005,40(12):897-899．

[3] 闫东.乌腺金丝桃正丁醇萃取物抗快速型心律失常物质基础及机制研究[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,2012.

[4] 董建勇,贾忠建,高丽萍.赶山鞭黄酮化合物抗PC12细胞DNA氧化应激损伤的作用[J].上海中医药杂志,2007,40(12):68-70.

[5] 徐颖,马轶,陈飞,等.金丝桃苷对培养的乳鼠心肌细胞的保护作用[J].沈阳药科大学学报,2000,17(5):365-366.

[6] 张杰,戴恩来,牛媛霞,等.乌腺金丝桃黄酮类化合物对肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞内Ca2+浓度的影响[J].中医研究,2012,25(3):60-64.

[7] 窦志强,戴恩来,薛国忠.乌腺金丝桃黄酮类化合物对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及血管紧张素Ⅱ的影响[J].中医研究,2012,25(9):55-58.

SimultaneousDeterminationofThreeFlavonoidsinHypericumAttenuatumChoisybyHPLC

LI Ji, BIAN Ya-nan, GAO Yan-yu, WU Bin

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

To determinate the contents of rutin, quercetin, and kaempferol inHypericumattenuatumchoisyby RP-HPLC. Methods: The Agilent TC-C18(4.6×150 mm, 5 μm)was used, using gradient elution with a mobile phase of acetonitrile as solvent A and 0.1% (v/v) phosphoric acid as solvent B; the flow rate was 1.0 ml/min; the column temperature was 30℃; the determination wavelength was 360 nm. Results: The three compounds were completely separated within 18 min. In the range of 20.0～80.0 μg/ml, 25.0～80. 0 μg /ml, 14.0～80.0 μg/ml, it was found that there existed a good linear relationship(r=0.999 0.0.999 2.0.999 2). The average recoveries (n=6) were 97.88% (RSD=1.16%), 96.57% (RSD=1.89%) and 97.68% (RSD=2.56%) respectively. The average contents of the three compounds were 0.02, 0.03, 0.01 mg/g respectively. Conclusion: The method is simple, fast and reliable, which can be used to determinate the contents of the three compounds inHypericumattenuatumchoisy．

Hypericumattenuatμmchoisy; HPLC; Rutin; Quercetin; Kaempferol

R284.1

A

1002-2392(2017)06-0021-03

2017-08-24

2017-11-16

国家自然科学基金项目(12511516，82102638);黑龙江省自然科学基金项目(H2015021)

李冀(1960-)，男，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：方剂配伍研究。

*通讯作者：武斌(1982-)，女，博士，助理研究员，黑龙江中医药大学博士后科研流动站在站工作人员，主要从事中药临床药效物质基础研究。