兰冬冬，朱国强，郭雄飞，田树革

(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)

不同生长期一枝蒿中3种化学成分的含量测定

兰冬冬1，朱国强2，郭雄飞2，田树革3*

(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的：建立HPLC-DAD法测定一枝蒿中一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素在不同生长期的含量。方法：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流动相为0.5 %冰乙酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～10 min,10.5%～14.5% B;12～23 min,22%～26% B;29～46 min,27.5%～28.5% B)，检测波长一枝蒿酮酸250 nm、绿原酸和木犀草素338 nm， 柱温35℃，流速：1 mL/min。结果：一枝蒿酮酸0.306 3～4.90 μg(r=0.999 9)；绿原酸在0.1338～2.14 μg(r=0.999 4)；木犀草素在0.023 9～0.143 μg(r=0.999 1) 线性范围内线性关系良好。平均回收率分别为95.7%(RSD=0.75%)，103.2%(RSD=1.77%)，100.7% (RSD=2.64%)。结论：该方法简便，可靠，准确度高，能够有效监测一枝蒿中3种化学成分在不同生长期的含量变化，为确定合理的采收时间提供理论依据。

一枝蒿;一枝蒿酮酸;绿原酸;木犀草素

一枝蒿为菊科蒿属苦艾组植物岩蒿ArtemisjarμpestrjsL.，维吾尔语称为“一孜乎艾曼尼”[1]，在维吾尔医理论指导下，通过长期临床实践和总结，一枝蒿清热解毒、消食健胃、散瘀消肿、抗过敏、解蛇毒、利胆等功效显著，主要用于感冒发烧、消化不良、腹胃胀痛、荨麻疹、蛇虫咬伤、肝炎等症[2-4]。一枝蒿作为一种疗效确切的药材，随着新疆民族药物研究领域的开发，已被应用于临床实践。例如在复方一枝蒿颗粒、蒿蓝感冒颗粒、复方一枝蒿眼用熏洗剂等产品中，也使用到一枝蒿药材。

据文献报道，田红林[5]等人研究发现一枝蒿花、茎、叶中一枝蒿酮酸，木犀草素的含量存在差异。一枝蒿在不同生长期(5～8月)形态特征变化明显[3,6]，不同部位(叶、茎、花)比重发生改变,各类化学成分的含量变化有待探究，此类文章却鲜有报道。倍半萜类、苯丙素类、黄酮类是一枝蒿的主要成分[7-9]，刘勇民[10]等人从一枝蒿中分离出倍半萜类化合物一枝蒿酮酸，张素挽[11]等人从一枝蒿中分离出苯丙素类化合物绿原酸，王燕[1]等人从一枝蒿中分离出黄酮类化合物木犀草素。HPLC法分别测定一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素[12-13]的技术较为成熟，本文确定一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素3种成分，采用 HPLC-DAD法同时测定。本法经济、简便、准确、稳定、可靠等优点，测定一枝蒿在不同生长期中3种化学成分的含量，为确定合理的采收时间和控制一枝蒿药材的质量提供理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器

安捷伦1220型高效液相色谱仪(安捷伦科技(中国)有限公司)；AB lO4-N型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托力多仪器有限公司)；手动移液器(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)；KQ-500DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

一枝蒿酮酸(宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号20160329)，绿原酸(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)，木犀草素(中国药品生物制品检定所，批号491-70-3)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，冰乙酸，甲醇为分析纯。

1.3 药材

一枝蒿药材采自银朵兰板房沟种植基地(2015年样品属于第一茬，2016年样品属于第2茬)，共7批(批号：20150515、20150618、20150705(花蕾初期)、20160513、20160608、20160705(盛花期)、20160715)。经新疆医科大学中医学院资源教研室徐海燕副教授鉴定。

2 实验方法及结果

2.1 供试品制备

取一枝蒿药材粉末(过3号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取50%甲醇50 mL,称重，超声提取40 min(300 W，40 KHz) ,放置室温，再称定，用50%甲醇补足减失的重量[14]，摇匀后经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤过液既得供试品，储存备用。

2.2 对照品溶液

分别精密称取对照品一枝蒿酮酸4.90 mg、绿原酸2.14 mg和木犀草素2.15 mg,分别置入10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后过0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤过液既得对照品，储存备用。

2.3 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)：流动相为0.5%冰乙酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～10 min,10.5%～14.5%B;12～23 min,22%～26%B;29～46 min,27.5%～28.5%B)，流速：

1 mL/min;检测波长250 nm和338 nm,柱温35℃,进样量10 μL,分析时间50 min，按上述色谱条件，不同检测波长HPLC色谱图见图1，三种化合物对照品及样品全波长扫描光谱图见图2。

图1 不同检测波长HPLC色谱图 (1.绿原酸;2.木犀草素;3.一枝蒿酮酸)

图2 3种化合物对照品及样品全波长扫描光谱图

2.4 标准曲线绘制

取2.2配制的一枝蒿酮酸和绿原酸对照品溶液分别稀释1、2、4、8、16倍，木犀草素溶液稀释15、20、30、60、90倍。按2.3项色谱条件，依次进样10 μL，以对照品浓度X(μg/μL)为横坐标，面积积分值Y为纵坐标，得到一枝蒿酮酸、绿原酸和木犀草素的线性回归方程结果如表1。

表1 一枝蒿酮酸、绿原酸和木犀草素的线性考察试验

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL(一枝蒿酮酸、绿原酸和木犀草素浓度分别为0.153 6 mg/mL、0.003 92 mg/mL、0.014 62 mg/mL),连续进样6次，依法测定，面积积分值的平均值分别为4 082.3、960.5、471.2。RSD值分别为1.46%、1.46%、1.89%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同批次(20160705)一枝蒿药材，按2.1项方法制备供试品溶液分别在0、2、4、8、24、48 h依法进行测定。测得供试品溶液中一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素面积积分值的平均值为2741.5、487.3、228.4。RSD分别为0.66%、1.06%、1.46% ，结果表明样品在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同批次(20160705)一枝蒿药材，取6份，精密称定1.0 g，按2.1项方法制备供试品，依法进样测定。结果一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素的面积积分值的平均值为2 734.8、492.0、230.2。RSD值为分别为1.86%、1.84%、2.70%。结果表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已测知含量的一枝蒿样品(20160705)6份，每份0.5 g，精密称定。分别加入一枝蒿酮酸、绿原酸，木犀草素，0.49 mg、0.196 mg、0.215 mg。按2.1项方法处理样品，依法进样测定。计算出一枝蒿酮酸回收率范围(95.1%～97.1%)，绿原酸回收率范围(99.9%～104.7%)，木犀草素回收率范围(97.3%～103.6%) 结果见表2，表明回收率符合要求。

表2 一枝蒿酮酸、绿原酸和木犀草素加样回收试验

2.9 样品测定

将采集7批不同生长期的一枝蒿样品，分别按2.1项方法制备成供试品溶液后进样分析，记录一枝蒿酮酸，绿原酸，木犀草素的峰面积，以外标法计算样品含量，一枝蒿酮酸在生长期和盛花期含量较高，绿原酸在生长期含量较高，木犀草素在花期含量较高。不同生长期样品含量测定结果见表3。

表3 一枝蒿在不同生长期中3种化合物含量变化

注：-表示未检测出

3 讨论

3.1 单波长的选择

本实验采用单波长多通道检测方法，避免单一波长检测不同类物质带来灵敏度差异大的问题[15]，在250 nm和338 nm波长下检测，可得到清晰图谱，三种物质在0.200～4.9 μg范围内，线性关系良好。相关系数高于0.999，加样回收率在95.7%～103.2%，RSD均小于3 %，本方法具有结果准确度可靠，快速，简便等优点，可用于一枝蒿中3种化合物的检测。

3.2 不同生长期比较

本文采用HPLC法进行了一枝蒿在不同生长期中3种化合物的含量测定，结果表明，在不同生长期中3种化合物含量变化明显，生长初期一枝蒿酮酸和绿原酸含量较高，盛花期木犀草素和一枝蒿酮酸含量较高，结合一枝蒿中各类化学成分的药理研究[2],可用于指导一枝蒿确定最佳的采收时节，从而有效控制药材质量和保障临床疗效。

3.3 不同采收茬次比较

根据采收记录，采收第一茬和第二茬的一枝蒿的植株形态特征在相同月份差异明显。实验结果表明，不同茬次一枝蒿样品所含一枝蒿酮酸和绿原酸的平均含量存在较大差异，这两种差异的成因可能与采收茬数，温度，气候，光照等有关。

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ContentsDeterminationofThreeChemicalConstituentsinArtemisiaRupestrisL.atDifferentGrowthStages

LAN Dong-dong1, ZHU Guo-qiang2, GUO Xiong-fei2, TIAN Shu-ge3

(1.SchoolofTCM,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China; 2.XinjiangChineseMedicineandEthnomedicineResearchInstitute,Urumqi830002,China; 3.CentralLaboratoryofXinjiangMedicalUnitersity,Urumqi830011,China)

Objective: To establish the HPLC-DAD method to determinate the content of Rupestonic acid, Chlorogenic acid, and Luteolin inArtemisiaRupestrisL. at different growth stages. Methods: The chromatographic column was Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) with 0.5% glacial acetic acid(A)-acetonitrile(B), gradient elution(0～10 min, 10.5%～14.5% B; 12～23 min, 22%～26%; 29～46 min, 27.5%～28.5% B). The detection wave of Rupestonic acid was about 250 nm, and Chlorogenic acid and Luteolin was about 338nm. The column temperature was 35 ℃, and the flow rate was 1 mL/min. Results: The linearity ranges of Rupestonic acid, Chlorogenic acid and Luteolin were 0.306 3～4.90 μg(r=0.999 9), 0.1338～2.14 μg(r=0.999 4), 0.023 9～0.143 μg(r=0.999 1), which showed that there was a good linear relationship. The average recoveries were 95.7%(RSD=0.75%), 103.2% (RSD=1.77%), and 100.7% (RSD=2.64%) respectively. Conclusion: This method is simple, reliable and accurate. It can effectively monitor the changes of the three chemical components inArtemisiaRupestrisL. at different growth stages, and provide the theoretical basis for determining the reasonable harvest time.

ArtemisiaRupestrisL.; Rupestonic acid; Chlorogenic acid; Luteolin

R284.1

A

1002-2392(2017)06-0024-04

2017-09-21

2017-10-15

第四次全国中药资源普查(试点)新疆中药民族药资源普查专项资助(2015-2016)

兰冬冬(1993-)，男，硕士研究生，研究方向：中药化学。

*通讯作者：田树革(1968-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向: 中药分析学、中药化学。