孙大菊，刘颖男，吕惠影，王雅丽，张玉成*

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，吉林 长春130033；3.吉林大学中日联谊医院 输血科，吉林 长春 130033)

长春地区120例健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围

孙大菊1，刘颖男2，吕惠影2，王雅丽3*，张玉成2*

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，吉林 长春130033；3.吉林大学中日联谊医院 输血科，吉林 长春 130033)

外周血T淋巴细胞亚群的检测已经广泛应用于多种疾病的诊断、探索疾病的发病机理、以及指导临床医生观察病患的发病规律和药物疗效观察等等。流式细胞术是检测外周血T淋巴细胞亚群的最主要的方法。目前，临床医院和科研机构应用的流式细胞仪主要来自美国的BD和Beckman Coulter公司。但是，各大医院及其科研机构应用的机器型号各有不同，并且，市面销售的荧光抗体厂家繁多，具有临床资质的流式细胞仪和试剂本就不多。更为重要的，T淋巴细胞亚群与种族、人种、年龄和生活状态能具有密切相关。为此，各临床机构有必要依据各地的实际情况，建立适合自己实验室(相关的仪器和试剂)独立的临床参考范围。为此，我们使用Beckman Coulter 公司的流式细胞仪(型号FC 500)和试剂，对长春地区120例健康成人外周血T淋巴细胞亚群进行检测，现总结如下。

1 材料与方法

1.1研究对象本研究选取吉林省长春市吉林大学中日联谊医院健康体检者120名，均为汉族，其中男性62名，女性58名，年龄20-60岁，其中女性平均年龄42.7岁，男性平均年龄41.5岁。所有的健康体检者均无近期吸烟、饮酒和服药，均无家族性遗传史；并且均没有细菌和病毒感染，HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒血清学指标均为阴性；心、肝、脾肺肾均未见异常。所有健康体检者均同意参加外周血T淋巴细胞亚群的检测，并且此检测完全符合中日联谊医院伦理道德标准。

1.2主要试剂和仪器所有试剂均为美国Beckman Coulter公司生产。主要包括：四色T淋巴细胞亚群抗体：CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 (试剂货号：6607013)；红细胞裂解液:OptiLyse B No-Wash Lysing Solution (试剂货号：IM1400)；荧光对照抗体：IgG2b-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD/IgG1-PC5；流式细胞仪：Beckman Coulter公司(型号FC 500)。

1.3样本处理采集健康体检者外周血1 ml，加入到带有EDTA抗凝的真空管中，混匀以防止血液凝固。分别取两只流式细胞仪上样管，命名为对照管和实验管；每管中加入100 μl抗凝全血，分别加入20 μl同型对照抗体和四色T淋巴细胞亚群抗体；充分混匀后，避光室温孵育20 min；然后向每管中加入红细胞裂解液500 μl，充分混匀后，室温避光20 min；加入PBS 500 μl，混匀，1 000 r/min 离心5 min；去掉上清，再重复清洗一次；最后去掉上清，加入500 μl PBS，上机。

1.4上机检测大体实验步骤如前所述[1]，简述如下：打开流式细胞仪，待仪器激光稳定后，利用荧光微球上机验证仪器正常；打开四色程序，利用CD45-FITC圈取淋巴细胞，每份样本选取细胞数10000个，样本采集后，利用CXP Analysis软件分析CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+占淋巴细胞的百分比。

1.5统计分析统计学方法采用SPSS 17.0进行t检验，数值用均值和标准差表示，P<0.05代表有统计学意义。

2 结果

2.1不同性别外周血T淋巴细胞亚群结果(见表1)，结果发现各项指标之间没有统计学差异(P>0.05)。

2.2不同年龄外周血T淋巴细胞亚群结果分为两组，分别为20-40岁和40-60岁，结果发现各项指标在不同年龄组中无统计学差异(P>0.05)，见表2。

2.3用百分位数法获得120例健康成人外周血T淋巴细胞的95%的可信区间，以此建立长春地区健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围，见表3。

表1 不同性别外周血T淋巴细胞亚群结果

表2 不同年龄外周血T淋巴细胞亚群结果

表3 120例长春地区健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围

3 讨论

T淋巴细胞是细胞免疫的重要组成部分，其对维持机体内环境稳定、机体的免疫防御、免疫监视等均具有举足轻重的重要作用。根据T淋巴细胞表面标志物CD4和CD8的不同，将T淋巴细胞分为CD3+CD4+和CD3+CD8+两种类型的T淋巴细胞[2]。应用流式细胞术技术检测外周血T细胞亚群的检测是临床上观察细胞免疫的最常用方法[3]。CD3+CD4+、CD3+CD8+以及CD4/CD8比值的检测对艾滋病、肿瘤、自身免疫病和移植排斥等疾病的评估、药物观察和疾病进展等具有重要的临床指导意义。但是各地由于使用仪器试剂、民族、地域和年龄的差异，造成T淋巴细胞亚群的参考范围各有不同。因此，有必要建立适用于本地区的健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考数值[4-6]。

本研究利用Beckman Coulter公司的流式细胞仪FC 500，结合四色荧光抗体检测了120例正常健康人外周血T淋巴细胞亚群，我们的研究发现T淋巴细胞亚群在性别和年龄上没有统计学差异，最后我们利用95%的可信区间，建立了适合我研究室的T淋巴细胞亚群的参考范围。与国内发表的当地健康成人T淋巴细胞亚群参考范围比较，我们的研究结果与湖南省差距较大[7]，而与北京地区差异较小[8]，这可能与地域差异有关。在国际上，Lee等[9]研究发现即便是不同性别的T淋巴细胞亚群也存在着差异，其研究结果显示男性CD3+CD8+淋巴细胞百分比高于女性，而CD3+和CD3+CD4+淋巴细胞百分比低于女性。

但是我们的研究也存在一些不足之处，第一：样本量选择120例健康成人外周血，采取的样本量不够大，我们的参考范围可能不能完全反应本地区的真实参考数值。第二：我们应用的仪器及试剂均为Beckman Coulter公司生产的，其他公司(例如BD公司)的检测结果是否与本室相同未能得知。第三:患者的个体生活环境未能完全获得，且我们只选择了汉族人口作为检测指标，未能全面包含本地区少数民族的检测结果。

总之，建立本地区的健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围，具有较重要的临床指导意义。

[1]曹林林,刘颖男,郑德明，等.乳腺癌患者手术前后T淋巴细胞亚群变化的实验研究[J].中国实验诊断学,2013,17(1):113.

[2]邵 彬,李惠平,邸立军，等.外周血淋巴细胞亚群监测对复发转移性乳腺癌的预测及预后价值[J].北京大学学报(医学版),2016,48(2):304.

[3]Tomasello E,Pollet E Vu Manh TP,et al.Harnessing Mechanistic Knowledge on Beneficial Versus Deleterious IFN-I Effects to Design Innovative Immunotherapies Targeting Cytokine Activity to Specific Cell Types [J].Front Immunol,2014,5(6):526.

[4]郭晓辉,张 丽,谢世平.艾滋病常见中医证型与T淋巴细胞亚群的统计学分析[J].世界中西医结合杂志,2016,11(1):52.

[5]童 春,郭 智,楼金星,等.异基因造血干细胞移植后T淋巴细胞亚群监测的临床意义[J].中国实验血液学杂志,2016,24(1):167.

[6]姚 斓,王燕嬉,张 伟.老年肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞的临床及意义[J].中国老年学杂志,2016,36(4):860.

[7]何志雄,李木兰,袁才佳，等.湖南省成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围[J].现代预防医学,2014,41(18):3395.

[8]韩呈武,于雪莹,王丽娜，等.北京地区健康成人外周血T淋巴细胞亚群的参考范围[J].临床检验杂志,2009,27(5):390.

[9]Lee BW,Yap HK,Chew FT,et al.Age- and sex-related changes in lymphocyte subpopulations of healthy Asian subjects:from birth to adulthood [J].Cytometry,1996,26(1):8.

吉林省卫生计生青年科研项[2014Q25]，白求恩医学科研支持计划项目[2013207058]

*通讯作者;*相同贡献

1007-4287(2017)12-2160-02

孙大菊(1980-)，女，硕士，主管技师，主要从事细胞病理学诊断及技术。

2017-02-15)