伍启康，李小燕，吴奎海

(1.佛山市第一人民医院 检验科，广东 佛山528000；2.广州医科大学第四附属医院 检验科，广东 广州510182)

临床分离16株耐碳青酶烯类肠杆菌科细菌耐药机制初步研究

伍启康1，李小燕2，吴奎海1

(1.佛山市第一人民医院 检验科，广东 佛山528000；2.广州医科大学第四附属医院 检验科，广东 广州510182)

目的了解佛山市第一人民医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药情况和耐药机制。方法2013年1月至2015年12月收集16株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，其中大肠埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，产酸克雷伯菌1株。利用VITEK2-compact微生物分析系统进行细菌鉴定及药敏试验。采用改良Hodges和MEM(美罗培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2双纸片协同试验进行耐药表型筛选。采用PCR法检测耐药基因blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48。结果16株细菌对亚胺培南、美罗培南均耐药。16株细菌Hodges均阳性，15株双纸片协同试验阳性。在11株大肠埃希菌，9株携带blaNDM-5，2株携带blaNDM-1。4株肺炎克雷伯菌携带blaNDM-5，1株产酸克雷伯菌携带blaKPC-2。结论我院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制以产blaNDM-5碳青霉烯酶为主。

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；NDM；耐药性

(ChinJLabDiagn,2017,21:2129)

肠杆菌科细菌作为临床常见的条件致病菌，其引起的重症感染越来越引起重视。碳青霉烯类药物抗菌谱广、抗菌活性强杀菌作用快的β-内酰胺类药物 ，其良好的细胞通透性、高度酶稳定性及较低的毒性等特点已成为目前临床治疗严重革兰阴性细菌感染最主要的抗菌药物之一 ，但随着耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的出现及不断的增多 ，使该类药物的临床应用受到了严峻的挑战[1]。本研究主要对临床分离耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1菌株来源我院检验科微生物室2013年1月至2015年12月分离的16株耐碳青霉烯类菌株，其中大肠埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，产酸克雷伯菌1株。标本来源包括痰液10例，尿液2例，血液2例，伤口1例，胆汁1例，同一患者只取第一次分离菌株。

1.2细菌鉴定和药敏试验利用法国生物梅里埃公司的VITEK2-compact仪器及其配套GN、AST-GN13卡进行菌种鉴定和药敏试验。美罗培南药敏试验采用K-B法，药敏纸片购自英国OXOID公司，根据临床实验室标准化委员会(CLSI)2015年标准判断结果，美罗培南的耐药标准都为R≤19 mm、敏感标准为S≥23 mm，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌A TCC27853。

1.3碳青霉烯酶表型检测依据CLSI M100-S23进行改良Hodges试验。MEM(美罗培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2协同试验，配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μl至MEM纸片上，无菌条件下自然干燥备用。配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板，将MEM和MEM-EDTA-Na2的纸片贴于琼脂表面。结果判定：含酶抑制剂纸片比单药纸片的抑菌圈直径相差≥5 mm，提示该菌产生金属 β-内酰胺酶[2]。

1.4主要仪器和试剂德国Eppendorf公司的PCR扩增仪器，Bio-Rad公司的凝胶仪,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒均为TaKaRa公司产品。

1.5PCR扩增细菌的DNA提取参考试剂盒说明书，-40℃保存。相关基因的PCR反应体系均为20 μl体积,其中含Mg2+的10×buffer 2 μl，dNTP 200 μmol/L，上下游引物0.2 μmol/L，DNA模板1 μl，TaqDNA聚合酶1U，加入灭菌去离子水至20 μl。blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48等碳青霉烯酶阳性菌株由广州医科大学第四附属医院微生物室李小燕提供,PCR扩增阳性并经测序验证，具体引物序列见表1。

表1 PCR反应的引物序列

1.6PCR产物序列分析产物送华大基因科技公司进行纯化并双向测序，利用DNAstar软件对测序结果进行序列校正，在GenBank中用blastn进行核酸同源性搜索，分析基因类型。

2 结果

2.1药敏试验16株肠杆菌对碳青霉烯类、头孢三代、头孢四代均耐药，对氨曲南、阿米卡星、左旋氧氟沙星耐药率分别为56.25%、25%、37.5%。

2.2碳青霉烯酶表型检测16株肠杆菌科细菌改良Hodges试验均阳性，证明均产碳青霉烯酶。15株MEM-EDTA-Na2协同试验阳性，仅1株产酸克雷伯菌阴性。

2.3PCR扩增在11株大肠埃希菌中，9株NDM-5基因阳性，2株NDM-1阳性。4株肺炎克雷伯菌均检测出NDM-5，1株产酸克雷伯菌KPC-2阳性。具体分布见表2。

3 讨论

本研究显示CRE对氨基糖苷类、氨曲南耐药率相对较低，但对多黏菌素和替加环素具有较高体外敏感性[1]。在临床上治疗此类感染可采取联合用药，如替加环素联合多粘菌素或磷霉素或氨基糖苷类、加酶抑制剂复合制剂联合氨基糖苷类或多黏菌素或氟喹诺酮类。

表2 16株肠杆菌科细菌耐药基因和主要抗生素MIC(μg /ml)分布

备注：CTX：头孢曲松；CAZ：头孢他啶；FEP：头孢吡肟；ATM：氨曲南；IMP：亚胺培南；AK：阿米卡星；LVX：左旋氧氟沙星

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药主要机制有四种[5]：①外膜蛋白变异合并AmpC、ESBLs等酶高产；②药物作用靶位的改变；③产生碳青霉烯酶；④外排泵作用。其中最主要的就是碳青霉烯酶，以A类和B类最常见，其中A类以KPC常见。B类为金属β-内酰胺酶，如IM P、NDM-1、VIM。在我国报道大肠埃希菌的耐碳青酶烯类耐药机制以产KPC-2和IMP-4碳青霉烯类酶为主。在本研究中，81.2%(9/11)大肠埃希菌中NDM-5阳性，仅2株NMD-1阳性。NDM基因至今有12个亚型，产NDM-5大肠埃希菌最早在英国发现。 NDM-5与NDM-1有两个位点氨基酸序列差异(Val88Leu 和Met154Leu)[6]。我国分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，以产KPC-2酶为主，同时伴有外膜蛋白(Ompk35、Ompk36)缺失[7,8]。5株肺炎克雷伯菌均携带NDM-5，与我国大部分地区携带KPC-2不同。1株产酸克雷伯菌KPC-2酶，KPC酶已有11个亚型，KPC酶可通过克隆菌株播散，也可通过质粒、转座子等移动性遗传元件播散。产NDM-5肠杆菌科细菌最近几年在我国和欧洲等地区逐渐有报道，LIU等[9]报道南昌一例患者分离于尿液标本，属于ST14型别。Bathoorn等[10]报道荷兰分离与产NDM-5，属于ST16型别。Zhang等[11]在上海发现2株大肠埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、1株奇异变形杆均检测NMD-5基因，而且四株菌DNM-5基因周围的遗传环境相同，可能与IncX3型质粒水平传播有关。

总之，我院CRE菌株存在NDM-5流行趋势，今后要规范化使用碳青霉烯类抗生素，加强本院该类菌株的流行病学调查，制定切实有效的感控措施，减少产碳青霉烯酶菌株的发生及播散，预防医院感染的发生。

[1]徐英春,肖永红,卓 超,等.中国碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的流行病学和防控策略[J].中国执业药师,2013,10 (4) :3.

[2]闫文娟,李轶王,王山梅,等.耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌耐药机制的研究[J].检验医学,2016,31(1) :56.

[3]Queenan AM,Bush K.Carbapenemases:the versatile beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2007,20(3):440.

[4]Nordmann P,Naas T,Poirel L.Global spread of Carbapenemase-producin Enterobacteriaceae[J].Emerg Infect Dis，2011,17(10):1791.

[5]安 军,蔡 挺,张 顺.耐碳青霉烯类大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌多重耐药研究进展[J].现代实用医学,2011,23(3):359.

[6]Hornsey M,Phee L,Wareham DW.A novel variant,NDM-5,of the New Delhi metallo-β-lactamase in a multidrug-resistant Escherichia coli ST648 isolate recovered from a patient in the United Kingdom[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(12):5952.

[7]杨丽君,陈 坚,杨 燕,等.耐药肺炎克雷伯菌基因型检测和同源性分析[J].中华检验医学杂志,2016,36(4) :318.

[8]梁权辉,徐韫健.耐碳青霉烯肺克雷伯菌和大肠埃希菌耐药机制研究[J].国际检验医学杂志,2014,35 (2) :165.

[9]Liu PP,Liu Y,Wang LH,et al.Draft Genome Sequence of an NDM-5-Producing Klebsiella pneumoniae Sequence Type 14 Strain of Serotype K2[J].Genome Announc,2016,4(2).pii:e01610.

[10]Bathoorn E,Rossen JW,Lokate M,et al.Isolation of an NDM-5-producing ST16 Klebsiella pneumoniae from a Dutch patient without travel history abroad,August 2015[J].Euro Surveill，2015,20(41).

[11]Zhang F,Xie L,Wang X,et al.Further Spread of bla NDM-5 in Enterobacteriaceae via IncX3 Plasmids in Shanghai,China[J].Front Microbiol,2016,7:424.

Resistancemechanismof16carbapenem-resistantEnterobacteriaceaeisolatesfromclinicalspecimen

WUQi-kang1，LIXiao-yan2，WUKui-hai1.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFourthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

ObjectiveTo investigate the resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in the First People’s Hospital of Foshan.Methods16 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates were collected from January 2013 to December 2015,including 11Escherichiacolistrains,4Klebsiellapneumoniaestrains and 1Klebsiellaoxytocastrain.The identification and antimicrobial susceptibility of the isolates were analyzed by Vitek2-compact microorganism analysis system.The modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2double-disk synergy test were screen out the carbapenem-resistant photypes.The genes of the carbapenemase,blaIMP,blaKPC,blaNDM,blaVIMandblaOXA-48were performed by PCR.Results16 isolates were all resistant to imipenem and meropenem.16 isolates and 15 isolates were positve for the modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2 double-disk synergy test,respectively.Of 11Escherichiacolistrains,9 strains carriedblaNDM-5and 2 strains carriedblaNDM-1.4Klebsiellapneumoniaestrains all habouredblaNDM-5and 1Klebsiellaoxytocastrain habouredblaKPC-2.ConclusionThe resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in the hospital is mainly production ofblaNDM-5carbapenemase.

Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae;Carbapenemase;NDM;Resistance

广东省佛山市医学类科技攻关项目(201308103)

1007-4287(2017)12-2129-03

R372

A

2017-05-13)