贾金海，何英辉，李 勇，李红蕖，彭子衡，张晓琳*

(1.河北医科大学门诊部，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，河北 石家庄 050017)

·论著·

应用γH2AX评估消炎痛对胃癌SGC-7901细胞DNA损伤的影响

贾金海1，何英辉1，李 勇2，李红蕖1，彭子衡3，张晓琳3*

(1.河北医科大学门诊部，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，河北 石家庄 050017)

目的以磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)为检测指标，观察分析非甾体类抗炎药物消炎痛对体外胃癌SGC-7901细胞DNA损伤的影响。方法分别选用消炎痛终浓度为0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L的培养液孵育体外培养的SGC-7901胃癌细胞，孵育时间均设置为0 h、12 h、24 h和48 h，处理结束，再采用免疫荧光技术观察得到各组SGC-7901细胞的平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率，采用Western-Blotting技术检测各组SGC-7901细胞的γH2AX蛋白水平。结果不同组细胞的平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率均呈先升高后降低趋势，其组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。γH2AX蛋白水平亦呈先升后降趋势，24 h组SGC-7901细胞γH2AX蛋白水平最高，与其他各时间组差异均有统计学意义(P<0.05)。结论以γH2AX作为标志物，评估化学药物对肿瘤细胞损伤的研究思路具有可行性和可操作性。

胃肿瘤；非甾体类抗炎药； DNA断裂，双链

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.021

多项流行病学调查显示，胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，在全球范围内，胃癌发病率排在所有恶性肿瘤的第4位，胃癌病死率更是位列全球癌症死亡谱的第2位[1-2]。目前，胃癌治疗的主要手段仍是以外科手术辅以化学药物治疗。近年来的研究表明，非甾体类抗炎药不仅能明显降低胃肠道肿瘤的发生风险，还具有明显的抑制肿瘤生长作用[3]，其机制可能与抑制胃癌细胞DNA损伤修复有关[4]。磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)是检测DNA双链断裂存在的“金标准”，一个γH2AX焦点就代表着一处DNA双链断裂，γH2AX的焦点数越多，表明细胞内的DNA双链断裂越多[5-6]。本研究以γH2AX为检测指标，探讨非甾体类代表性药物消炎痛对体外胃癌细胞DNA损伤的影响。

1 资 料 与 方 法

1.1主要实验材料、试剂及设备 胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究院，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，小鼠抗人γH2AX单克隆抗体、小鼠抗人β-actin单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体为北京中山生物技术有限公司产品，消炎痛为北京东亚生物制品研究所产品，FV1000激光共聚焦扫描显微镜为OLYMPUS公司产品。

1.2细胞培养和实验分组 选用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μmol/L链霉素的RPMI-1640培养基复苏传代后，接种于100 mL培养瓶，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞培养至对数生长期时，加入消炎痛处理，并使各实验组培养液终浓度分别达0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L，分别于继续孵育至12 h、24 h、48 h时，收集细胞用于实验。每组实验重复3次。

1.3激光共聚焦扫描显微镜检测γH2AX焦点 应用倒置生物显微镜计数SGC-7901胃癌细胞，并将细胞浓度调整至1×107个/mL，然后按照每孔2 mL的体积，接种SGC-7901细胞至已放有盖玻片的6孔板中，选用含有不同浓度消炎痛药物的培养液孵育细胞，待各组干预结束，用4%多聚甲醛冰上固定细胞30 min，PBS溶液洗涤，0.2% Triton-X 100破膜15 min，PBS溶液洗涤细胞3次，5 min/次，山羊血清工作液37 ℃封闭细胞1.5 h，一抗4 ℃孵育细胞过夜，荧光二抗孵育细胞1 h，DAPI室温避光孵育细胞10 min，待其自然凉干，加入抗淬灭剂，用激光共聚焦扫描显微镜计数细胞，每组至少计数100个细胞，之后用Image Pro Plus软件计算各组平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率。平均γH2AX焦点数=γH2AX焦点总数/细胞总数，γH2AX焦点细胞率=含γH2AX焦点的细胞数/细胞总数×100%。

1.4Western-Blotting技术检测γH2AX蛋白 应用倒置生物显微镜计数SGC-7901胃癌细胞，并将细胞浓度调整1×107个/L，按照每瓶4 mL的体积，接种各组SGC-7901细胞于培养瓶中，待处理因素干预结束，弃掉培养液，预冷的PBS溶液漂洗细胞3次，每次5 min，细胞刷刮取细胞，然后将细胞溶液转移到1.5 mL的EP管中，4 ℃、1 000 g条件离心细胞溶液3 min，弃上清，每管加入裂解液A溶液1 mL(用前加PMSF，终浓度为1 mmol/L)，涡旋振荡15 s，冰浴15 min，每管加入NP-40溶液6 μL，振荡混匀，4 ℃、12 000 g条件离心5 min，弃尽上清，每管再加入裂解液B溶液0.1 mL(用前加PMSF，终浓度1 mmol/L)，涡旋振荡15 s，冰浴20 min，4 ℃、12 000 g条件离心20 min，上清液即为核蛋白提取液。采用Lowry法定量蛋白质，然后进行15%的SDS-PAGE凝胶电泳，4 ℃、80 V条件湿转硝酸纤维素膜(NC膜)1 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，小鼠抗人γH2AX单克隆抗体孵育细胞2 h，Tween-PBS溶液(PBS溶液中加入0.05%Tween-20)洗膜3次，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体孵育细胞1 h，Tween-PBS溶液洗膜3次，最后，采用ECL化学发光法显影、定影，应用凝胶成像分析系统扫描计算各组灰度值，内参蛋白选用β-actin。

1.5统计学方法 应用SPSS 21.0软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验、SNK-q检验和重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1平均γH2AX焦点数比较 各时点平均γH2AX焦点数均呈先升高后降低趋势，其组间、时点间、组间·时点间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2γH2AX焦点细胞率比较 各时点γH2AX焦点细胞率均呈先升后降趋势，其组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 不同浓度组各时间点平均γH2AX焦点数比较 个)

表2不同浓度组各时间点γH2AX焦点细胞率比较

组别0h12h24h48h 0μmol/L 24.61±2.4424.31±3.8525.90±1.2223.84±3.06200μmol/L 24.31±3.8535.93±1.0446.55±2.6737.26±1.38400μmol/L 25.90±1.2247.47±1.8875.89±2.4852.62±2.12600μmol/L 23.84±3.0642.46±3.2158.21±2.8947.72±2.10组间 F=261.152 P=0.000时点间 F=220.218 P=0.000组间·时点间F=39.321 P=0.000

2.3不同组γH2AX蛋白水平比较 不同时间组γH2AX蛋白水平呈先升高后降低趋势，0 h组低于12 h组、2 4h组和48h组(P<0.05)，12 h组低于24h组、48h组(P<0.05)，48 h组与24 h组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3不同时间γH2AX蛋白水平比较

组别γH2AX蛋白0h9.620±1.81212h17.570±2.070*24h37.577±2.724*#48h33.687±2.152*#F106.979P0.000

*P<0.05与0 h比较 #P<0.05与12 h比较(SNK-q检验)

3 讨 论

DNA损伤有多种形式，包括DNA单链断裂、DNA与DNA的交联、DNA与蛋白质的交联、DNA双链断裂等，其中，双链断裂是DNA损伤中最为严重的形式，会影响DNA的双螺旋结构，导致DNA遗传物质发生转变，具体表现为染色体重排或染色体缺失，双链断裂若得不到及时修复，最终会导致细胞的增殖抑制直至凋亡[7]。研究表明，外部环境和生物体自身因素，如电离辐射、遗传毒性化学物质、化疗药物等，均可以诱发双链断裂的发生[8]。真核细胞DNA是与组蛋白以核小体的形式存在于细胞核内，组蛋白主要包括H1、H2A、H2B、H3和H4五种。组蛋白H2AX是组蛋白H2A的一个亚型，其羧基末端有一段高度保守的丝氨酸-谷胺酰胺-谷氨酸结构域，该结构域中的139位丝氨酸可以被磷脂酰肌醇-3-激酶家族的成员如毛细血管共济失调突变基因、DNA依赖性蛋白激酶等磷酸化。双链断裂发生后，被DNA损伤感应因子识别，感应因子磷酸化毛细血管共济失调突变基因，磷酸化的毛细血管共济突变基因又磷酸化双链断裂处的组蛋白H2AX上述结构域中的139位丝氨酸，从而形成磷酸化组蛋白H2AX，即γH2AX[9-10]。γH2AX可以从双链断裂处向两端扩散，形成可以通过免疫标记并在荧光显微镜下观察到的γH2AX焦点。γH2AX焦点与双链断裂在数量上存在一一对应关系，在真核细胞的整个周期中均可检测到，γH2AX分析技术已成为检测双链断裂的金标准[11-13]。

消炎痛，又名吲哚美辛，是非甾体类抗炎药的代表性药物，流行病学、动物模型和临床研究均发现，长期使用非甾体类抗炎药对消化道肿瘤有抑制作用[14-15]。本研究以γH2AX为检测指标，观察消炎痛与胃癌SGC-7901细胞双链断裂的关系，结果显示随培养液中消炎痛浓度增加，SGC-7901细胞平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率均呈升高趋势，至400 μmol/L时，平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率达到最高值，显著高于200 μmol/L组(P<0.05)和600 μmol/L组(P<0.05)；同时，随消炎痛溶液孵育时间延长，SGC-7901细胞平均γH2AX焦点数和γH2AX焦点细胞率亦均呈现出先升高后降低趋势，以孵育24 h组为最高，显著高于12 h组(P<0.05)和48 h组(P<0.05)。表明消炎痛作用于胃癌SGC-7901细胞，致其细胞核中γH2AX焦点变化的效应具有浓度依赖性和时间依赖性。此外，析因方差分析结果还表明，消炎痛致SGC-7901细胞γH2AX焦点变化的作用浓度和作用时间具有显著的协同效应(P<0.05)。

免疫荧光结果确定了消炎痛作用于胃癌SGC-7901细胞的最佳浓度是400 μmol/L，最佳时间是24 h。在此条件下，本研究进行了Western-Blotting实验，观察了经含消炎痛培养液孵育后，胃癌SGC-7901细胞γH2AX蛋白的表达水平变化，结果显示 随作用时间延长，γH2AX蛋白相对表达水平呈先升后降趋势，24 h组的蛋白水平明显高于其他各组(P<0.05)。表明了消炎痛对胃癌SGC-7901细胞γH2AX变化的影响。

γH2AX是DNA双链断裂的标志，与双链断裂数量呈1∶1关系，能够快速而敏感地反映DNA的受损情况[16]。本研究以γH2AX为检测指标，间接评估了非甾体类抗炎药物消炎痛对胃癌SGC-7901细胞DNA损伤的影响，结果显示以γH2AX作为标志物，评估化学药物对肿瘤细胞损伤的研究思路具有可行性和可操作性。

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2017-06-16；

2017-07-24

河北省高等学校科学研究项目(Z2012079)

贾金海(1976-)，男，河北曲周人，河北医科大学门诊部副主任医师，医学硕士，从事消化系统疾病诊治研究。

*通讯作者

R735.2

B

1007-3205(2017)12-1448-03

刘斯静)