王文斌，刘 兵，王天阳，吕海涛，刘学青

(1.河北医科大学第二医院肝胆外科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院肿瘤科，河北 石家庄 050051)

·论著·

信号转导与转录激活因子3、细胞周期素D1在胆管癌组织中的表达及意义

王文斌1，刘 兵2，王天阳1，吕海涛1，刘学青1

(1.河北医科大学第二医院肝胆外科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院肿瘤科，河北 石家庄 050051)

目的检测信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、细胞周期素D1(Cyclin D1)在胆管癌组织中的表达并分析其临床意义。方法采用免疫组织化学技术检测STAT3、Cyclin D1在70例胆管癌组织和15例非肿瘤胆道上皮组织中的表达情况。结果免疫组织化学结果显示70例胆管癌组织和15例非肿瘤胆道上皮组织中STAT3、Cyclin D1阳性表达率分别为61.4%、33.3%和42.9%、13.3%。STAT3、Cyclin D1蛋白在胆管癌组织中的表达均明显高于非肿瘤胆道上皮组织(P<0.05)。STAT3蛋白表达与胆管癌的临床分期、淋巴结转移和组织学分级明显相关(P<0.05)；胆管癌组织中Cyclin D1蛋白表达与淋巴结转移和组织学分级明显相关(P<0.05)。STAT3与Cyclin D1表达呈明显正相关关系(P<0.05)。STAT3、Cyclin D1蛋白共阴性表达组生存时间明显长于共阳性表达组(P<0.01)。结论STAT3、Cyclin D1可能是反映胆管癌发生发展的重要生物学指标。

胆管肿瘤;转录激活因子3；细胞周期素D1

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.009

胆管癌是一种相对较少见的肿瘤，占肝胆系统肿瘤的10%～15%，人类肿瘤的2%～3%[1-2]，但发生率逐年升高[3]。根据起源部位不同分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，肝外胆管癌又分为肝门胆管癌和远端胆管癌。由于发病隐匿，具有浸润生长和淋巴、神经转移等特点，综合治疗效果不理想[4]，5年生存率20%～40%[5]。故研究胆管癌的发生、发展、浸润、转移等生物学特点和机制，对于胆管癌的治疗有着重要指导意义。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)位于细胞质中，当被上游相关信号激活后，其磷酸化形成二聚体或与STAT3的其他成员形成异质二聚体。激活的STAT3复活物移位到细胞核中作用于STAT3目的基因，促进细胞周期素D1(Cyclin D1)等的表达，进而引起组织细胞的癌变、增殖和侵犯。已有研究显示STAT3在多种实体肿瘤中均起到促癌作用[6-7]。Cyclin D1是STAT3的下游基因，其高表达可促进细胞大量增殖，进而引起癌变，与食管癌、肝癌等肿瘤的发生密切相关[8-9]。本研究采用免疫组织化学技术检测STAT3、Cyclin D1在胆管癌中的表达并探讨其临床意义，旨在为胆管癌的诊断和治疗提供一个新的靶点。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选择2009年3月—2014年4月在河北医科大学第二医院手术切除经病理证实的胆管癌标本70例(腺癌62例，黏液腺癌3例，乳头状腺癌3例，鳞癌1例，神经内分泌癌1例)，男性50例，女性20例，年龄35～82岁，平均(59.0±9.7)岁。其中，高分化31例，中分化18例，低分化21例。按照美国癌症学会肝外胆管癌TNM分期(2006版)：Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例，Ⅳ期3例；Ⅰ+Ⅱ期为早期，Ⅲ+Ⅳ为进展期。所有患者术前未经放化疗。选择15例非肿瘤胆管上皮组织作为对照组，男性9例，女性6例，年龄32～61岁，平均(46.7±9.1)岁。

1.2试剂 鼠抗人STAT3单克隆抗体为英国Abcam公司产品，鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体为美国Zymed公司产品，ElivisionTM plus检测试剂盒购自福州迈新生物公司。

1.3方法

1.3.1检测方法 采用免疫组织化学链霉亲和素-过氧化物酶法检测标本中STAT3和Cyclin D1蛋白的表达。蜡块经4 μm厚度连续切片后，置烤箱75 ℃烤片过夜；切片脱蜡至水：石蜡切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，95%、85%、75%酒精各5 min，自来水冲洗。用0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。抗原修复：放入枸橼酸盐缓冲液中(修复盒)加热，保持92～98 ℃，15 min，室温下自然冷却。0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。除去PBS，滴加一抗(STAT3稀释浓度为1∶200，Cyclin D1稀释浓度为1∶200)，湿盒内4 ℃冰箱内过夜。0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗5 min×3次。除去PBS液，滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min。0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。除去PBS液，滴加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min。0.1 M PBS(pH 7.4)冲洗3 min×3次。除去PBS液，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3 min。自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化。梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片剂封片。染色过程中以结肠癌组织切片作为阳性对照，阴性对照以PBS替代一抗。

1.3.2结果判定 STAT3阳性细胞为胞浆或胞质内出现棕黄色的着色颗粒，Cyclin D1阳性染色位于胞核，为黄色、深棕黄色颗粒，从阳性肿瘤细胞百分数和染色深浅两个方面评分。按阳性区域染色强度评分，无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；按阳性细胞所占比例评分，无阳性细胞计0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。两分值相乘，0～3分为阴性，>3分为阳性。

1.4随访 通过电话、信访、门诊检查的方式随访，随访率为100%。

1.5统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Pearson直线相关分析；用Kaplan-Meier生存曲线法计算患者生存率并行log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1STAT3、Cyclin D1在胆管癌组织中的表达 STAT3主要表达于胆管癌细胞的胞浆和胞核，以胞浆为主，呈棕黄色颗粒。70例胆管癌组织中43例(61.4%)STAT3蛋白表达阳性，15例非肿瘤胆道上皮组织中6例(33.3%)STAT3蛋白表达阳性。STAT3蛋白在胆管癌组织中的表达高于非肿瘤胆道上皮组织中的表达，差异有统计学意义(χ2=3.967，P=0.046)。Cyclin D1阳性染色位于细胞核内，为黄色、棕黄色颗粒。在部分正常胆管组织和胆管癌细胞中，细胞浆也呈淡棕黄色着色。70例胆管癌组织中30例(42.9%)Cyclin D1蛋白表达阳性，15例非肿瘤胆道上皮组织中2例(13.3%)Cyclin D1蛋白阳性表达。Cyclin D1蛋白在胆管癌组织中的表达高于非肿瘤胆道上皮组织中的表达，差异有统计学意义(χ2=4.587，P=0.032)。见图1，图2。

2.2STAT3、Cyclin D1表达与胆管癌临床病理特征的关系 STAT3表达与胆管癌临床进展相关，Ⅲ+Ⅳ期STAT3蛋白表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，中低分化组STAT3蛋白表达明显高于高分化组(P<0.05)，淋巴结转移组STAT3蛋白表达明显高于高分化组(P<0.05)；年龄、性别、肿瘤大小间STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。Cyclin D1表达与胆管癌组织学分级密切相关，中低分化组Cyclin蛋白表达明显高于高分化组(P<0.05)，淋巴结转移组Cyclin D1蛋白表达明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)；年龄、性别、肿瘤大小、临床分期间Cyclin D1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图1STAT3在胆管癌组织中的表达(免疫组织化学染色×20)

Figure1ExpressionofSTAT3incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

图2CyclinD1在胆管癌组织中的表达(免疫组织化学染色×20)

Figure2ExpressionofCyclinD1incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

表1 胆管癌组织中STAT3、Cyclin D1蛋白表达与胆管癌临床病理特征的关系Table 1 Relationship between expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma and clinical pathological factors (例数，%)

2.3STAT3与Cyclin D1蛋白相关分析及对胆管癌患者预后的影响 在STAT3蛋白阳性表达43例中Cyclin D1蛋白表达阳性23例，而STAT3蛋白阴性表达27例中Cyclin D1蛋白表达阴性20例，STAT3与Cyclin D1蛋白在胆管癌组织中的表达呈明显正相关关系(r=0.271，P=0.023)。Kaplan-Meier生存曲线显示，STAT3与Cyclin D1共同阳性表达组中位生存时间为13个月，共同阴性表达组中位生存时间为47个月。STAT3与Cyclin D1共同阴性表达组生存时间明显长于共同阳性表达组，差异有统计学意义(χ2=19.560，P=0.000)，见表2，图3。

表2 胆管癌组织中STAT3与Cyclin D1表达的相关性Table 2 Correlation between expression of STAT3 andCyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues (例数)

图370例胆管癌生存曲线

Figure3Theoverallsurvivalcurveof70casesofpatientswithcholangiocarcinoma

3 讨 论

胆管癌的发生是一个多因素、多基因改变相互作用的复杂过程，胆管癌的预后因而也受到各种因素的影响．目前在对肿瘤的具体发生机制不甚明了的情况下，对肿瘤的治疗仍以手术为主，辅以放疗、化疗及其他治疗，但是效果仍然很差。因此，寻找能有效反映胆管癌恶性生物学行为，判断患者预后的指标就显得很重要。

STAT3是一类结构保守的转录因子家族成员，除了具有STAT 家族成员共同的结构之外，还含有N端氨基酸保守序列、与蛋白相互作用的螺旋区域、DNA结合域、SH2结构域、保守的Tyr705以及位于C端的编码转录激活区域。作为多种细胞因子及生长因子下游重要的信号转录因子，广泛参与细胞的生长、增殖、分化过程，维持机体微环境稳态，调控免疫功能。STAT3目前被公认为癌基因之一，是肿瘤研究的热点。在正常细胞中，其活性是瞬间的，当在某些外在刺激或内在因素的作用下[10]，STAT3持续性活化，并且持续位于细胞核中，恒定地调控目的基因的转录，如抗凋亡基因MCL-1、诱导细胞凋亡基因Bak、细胞周期调控基因Cyclin D1以及血管内皮生长因子、生存素等，促使细胞恶性增殖，最终导致恶性肿瘤的产生[11-12]。

Cyclin D1是细胞周期素家族成员之一，Cyclin D1基因位于第11号染色体短臂上，长约15 kd，含5个外显子和4个内含子，编码由295个氨基酸组成，相对分子质量为34 000的蛋白质。Cyclin D1与依赖周期素的激酶和激酶抑制因子是细胞生长发育过程中细胞周期调控的主要因子。Cyclin D1在正常细胞中的功能是促进细胞周期从G1期进入S期，启动DNA的合成，参与细胞的增生、分化和凋亡，当其表达过量时，可使细胞持续增殖，若失控则导致多种肿瘤的形成，故也被视为一种癌基因[13-14]。国内学者证实通过转染诱导Cyclin D1过表达促进了宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖和上皮间质转化[15]。

STAT3通过激活相关的靶基因，能够引起细胞癌变的关键性基因产物的过度表达，Cyclin D1为其重要靶基因之一。STAT3可能通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶/细胞周期素复合物与细胞周期依赖性激酶抑制因子成员之间的平衡，缩短细胞周期中G1至S这一时相，进而调节恶性肿瘤细胞异常增殖，介导细胞恶性转化。有学者报道STAT3、Cyclin D1可能促进了恶性黑色素瘤的发生、浸润和淋巴转移，两者具有协同作用[16]。Li等[17]报道食管鳞癌STAT3、Cyclin D1阳性表达患者的预后差。表明两者在肿瘤预后判断方面存在一定价值。

目前STAT3、Cyclin D1在胆管癌中的共表达情况以及预后的相关性未见报道。本研究发现，STAT3、Cyclin D1在胆管癌组织中的表达较非肿瘤胆管组织中的表达明显升高。STAT3蛋白表达与胆管癌的临床进展、淋巴结转移以及组织学分级密切相关，临床进展期(Ⅲ+Ⅳ期)、有淋巴结转移以及中低分化胆管癌患者的STAT3阳性表达率明显高于临床早期(Ⅰ+Ⅱ期)、无淋巴结转移及高分化患者；而Cyclin D1蛋白表达与胆管癌的淋巴结转移以及组织学分级密切相关，有淋巴结转移以及中低分化胆管癌患者的Cyclin D1阳性表达率明显高于无淋巴结转移及高分化患者。说明STAT3、Cyclin D1可能参与了胆管癌的发生、增殖、浸润、转移。STAT3与 Cyclin D1的表达呈高度一致性，呈明显的正相关关系，表明STAT3可通过调控Cyclin D1促使细胞周期的运转，从而参与胆管癌发生发展，并促进胆管癌的浸润转移。生存分析显示两者共同阳性表达患者的预后明显差于阴性表达患者，表明两者在胆管癌预后分析方面具有重要的参考价值，可作为胆管癌患者预后评估的有效指标。

[1] Soares KC,kamel I,Cosgrove DP,et al. Hilar cholangiocarcinoma:diagnosis,treatment options,and management[J]. Hepatobiliary Surg Nutr,2014,3(1):18-34.

[2] 王湛博,韦立新.胆管癌肿瘤标记物研究进展[J].海南医学,2013,24(9):1322-1325.

[3] 孙备,刘欢.肝门胆管癌的术前可切除性评估[J].中国普外基础与临床杂志,2014,21(3):268-272.

[4] Merla A,Liu KG,Rajdev L. Targeted therapy in biliary tract cancers[J]. Curr Treat Options Oncol,2015,16(10):48.

[5] 陈孝平,黄志勇,陈义发,等.肝门部胆管癌根治术肝切除范围的合理选择[J].中国普通外科杂志,2013,22(1):8-9.

[6] Wu P，Wu D，Zhao L，et al. Prognostic role of STAT3 in solid tumors:a systematic review and meta-analysis[J]. Oncotarget,2016，7(15)：19863-19883.

[7] 戴海龙,董成,徐玲,等.氧化苦参碱和苦参碱通过调控酪氨酸激酶-信号转导及转录激活因子信号通路对肝癌细胞AMMC-7721增殖凋亡的影响[J].中华实验外科杂志,2017,34(1):61-64.

[8] Zhao S,Yi M,Yuan Y,et al. Expression of AKAP95,Cx43,Cyclin E1 and Cyclin D1 in esophageal cancer and their association with the clinical and pathological parameters[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(5):7324-7332.

[9] 王斌锋,朱昱,王铖,等.PAK5和CyclinD1在肝细胞肝癌中的表达及预后意义[J].中华普通外科杂志,2016,31(4):312-315.

[10] Bhola NE,Johnson DE,Grandis JR. A sensible approach to targeting STST3-mediated transcription[J]. Ann Transl Med,2016,4(Suppl 1):S57.

[11] 陈伟,梅平，陈思聪,等.Cyclin D1与VEGF在肝内胆管癌中的表达及临床意义[J].实用医学杂志,2012,19(21):3394-3396.

[12] 安峰,何薇薇,林媛媛,等.涎腺黏液表皮样癌中信号传导和转录激活因子3、血管内皮生长因子的表达及临床意义[J].河北医科大学学报,2015,36(5):540-546.

[13] Dhingra V,Verma J,Misra V,et al. Evaluation of Cyclin D1 expression in head and neck squamous cell carcinoma[J]. J Clin Diagn Res,2017,11(2):EC01-04.

[14] Park GH,Sung JH,Song HM,et al. Anti-cancer activity of Psoralea fructus through the downregulation of cyclin D1 and CDK4 in human colorectal cancer cells[J]. BMC Complement Altern Med,2016,16(1):373.

[15] 王平,刘珊,程波,等.Cyclin D1过表达对子宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖及上皮间质转化的影响[J].中华病理学杂志2017,46(3)：187-192.

[16] 温立霞,吴为民,杨成良,等.转录信号传导与转录激活因子3、细胞周期素D1在皮肤恶性黑色素瘤组织的表达及意义[J].中华实验外科杂志,2016,33(8):2016-2018.

[17] Li H,Xiao W,Ma J,et al. Dual high expression of STAT3 and cyclin D1 is associated with poor prognosis after curative resection of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol,2014,7(11):6989-7998.

TheexpressionandclinicalsignificanceofSTAT3andCyclinD1incholangiocarcinoma

WANG Wen-bin1, LIU Bing2, WANG Tian-yang1, LYU Hai-tao1, LIU Xue-qing1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China； 2.DepartmentofOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of signal transducer and activator of transcription 3(STAT3 ) and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression of STAT3 and Cyclin D1 in 70 cases of cholangiocarcinoma and 15 cases of non-tumor bile duct epithelium.ResultsThe expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(61.4%, 42.9%) was significantly higher than that in non-tumor bile duct epithelium(33.3%, 13.3%)(P<0.05). STAT3 expression significantly correlated with clinical stage, lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of STAT3 was significantly higher in the stage Ⅲ+Ⅳ group , lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated group than those in stageⅠ+Ⅱ group, no lymph nodes metastasis group and well-differentiated group(P<0.05). Cyclin D1 expression was significantly correlated with lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of Cyclin D1 was significantly higher in the lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated than those in no lymph nodes metastasis group and well-differentiated. A significant correlation was found between the expressions of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(P<0.05). The survival time of negative expression of STAT3 and Cyclin D1 group was longer than that of positive expression of STAT3 and Cyclin D1 group(P<0.01).ConclusionSTAT3 and Cyclin D1 may be important biomarkers in carcinogenesis and progression of cholangiocarcinoma.

bile duct neoplasms; activating transcription factor 3； Cyclin D1

2017-05-05；

2017-06-02

王文斌(1973-)，男，河北保定人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事肝胆外科疾病诊治研究。

R735.8

A

1007-3205(2017)12-1397-05

刘斯静)