暴 甜，苏淑钗，高 赫，陈一帆

（北京林业大学 省部共建森林培育与保护重点实验室，北京 100083）

毛梾优良无性系组培体系建立

暴 甜，苏淑钗，高 赫，陈一帆

（北京林业大学 省部共建森林培育与保护重点实验室，北京 100083）

近年来，毛梾作为油料树种，其果实油用价值被逐步开发利用，但因优株材料数量有限，传统的实生苗繁殖变异系数大，而无性繁殖技术尚不成熟，繁殖系数低，难以满足短期内提供大量苗木的需求，因此需要建立毛梾组培体系达到快速繁殖目的。目前对毛梾组培的研究仅到初代培养，污染率高诱导率低，生产中无法应用。本试验以结果盛期的优良单株为试材，选用一年生休眠枝水培出的新梢为外植体，进行毛梾优良无性系组培技术研究。结果表明，最佳消毒方式为2%次氯酸钠消毒15 min，污染率4.4%；最适基本培养基为DKW培养基，试管苗生长良好，叶片健康舒展；继代培养采用DKW+6-BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+ GA30.5 mg/L为宜，增殖系数为15.56，平均苗高6.22 cm；生根培养采用1/2DKW+NAA0.2 mg/L为宜，生根率为62%（最高可达74%），平均根数6.5，平均根长2.9 cm；移栽时选用经过高压灭菌后的蛭石：珍珠岩：草炭1:2:1基质，可达到94.4%的成活率。

毛梾；组织培养；生根

毛梾Cornus walteri Wanger.属山茱萸科梾木属，又名车梁木。毛梾不仅是优良的用材树种，同时也是优良的城市绿化和水土保持树种[1-2]。毛梾果肉和种仁均含油脂，果实含油率31.8%～41.3%[3]。中国拥有丰富的油料植物资源，且国内植物油市场发展迅速，因此开发木本油料树种，既能丰富食用油品种，又可以将生产过程中的残渣充分利用制作生物质燃油原料，具有很大的开发价值[2]。毛梾作为油料树种，近年其果实被用于生产新型木本食用油、保健品、生物柴油开发利用，发展潜力很大。

毛梾繁殖方法以实生苗为主，繁殖系数低，且童期长，进入结果期晚，后代变异率高，产量低。但无性繁殖能保持母树优良遗传特性，实现提早结果，丰产稳产，故建立毛梾优良无性系极其必要。毛梾的无性繁育方式如扦插技术尚不成熟，生根率低[4-5]；嫁接技术繁殖系数低，且优良母株数量有限，以上方法均不能满足企业规模繁育需求。现代无性繁殖育苗技术中，植物组培技术能够在短时间内实现快速大量繁殖，获得基因型一致的优良无性系种苗[6-7]。

目前国内外关于梾木属组织培养研究主要集中在光皮树[8]、红瑞木[9-10]等，均已建立组培快繁体系，但关于毛梾组织培养方面的研究鲜有报道，仅有张丹[11]对毛梾初代培养的研究，且存在污染率高诱导率低的问题。同时至今未见有关毛梾继代培养和生根及移栽技术的研究报道，生产中无法应用毛梾组培技术进行快繁。因此，建立并完善毛梾的组织培养与快繁体系，对促进毛梾产业的发展具有十分重要的现实意义。本研究以北京林业大学内优良毛梾植株为试材，建立毛梾组织培养体系，所得无性系种苗均能保持母树的优良结果习性，为毛梾试管苗的工厂化生产和后续遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以毛梾优良单株为研究对象。外植体采集于北京林业大学校园内30年生结果盛期的优良单株毛梾树。2015年3月上旬剪取一年生外围进入结果期的休眠枝，带回实验室水培，10-15 d后取新萌出的嫩梢作为培养材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒

枝条水培后，切取3～5 cm新萌出的新梢，剪去叶片，留叶柄基部，放在自来水下流水冲洗约1.5 h；将外植体置于超净工作台，用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～5次，在消毒剂中浸泡10～15 min，并不断摇动，再用无菌水冲洗3～5次。

试验设置2个因素，即消毒剂和消毒时间，分别选用2%次氯酸钠溶液和10%次氯酸钙溶液，消毒10 min、12 min、15 min，共6个处理。将消毒处理后的茎尖或茎段，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，切成0.5～1.5cm小段，剪去接触消毒剂的切口部位。每个处理30瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。15 d后观察、记录外植体生长情况，统计外植体的存活率和污染率。

1.2.2 基本培养基筛选

采用MS、1/2MS、WPM、DKW4种基本培养基，以茎段为外植体进行培养，添加生长调节剂6-BA 0.5 mg/L和NAA0.1 mg/L。每个处理30瓶，每瓶接种1个茎段，3次重复。7d后观察、记录外植体生长情况，从外植体增殖生长情况等方面来进行比较。

1.2.3 继代培养

外植体经接种培养后，当试管苗长至3～5 cm长，切成含1～2个腋芽的小段进行继代培养。试验以DKW为基本培养基，设置不同浓度比例的6-AB、NAA、GA3，共12个处理（见表3），每个处理10瓶，每瓶接种3个茎段，3次重复。40 d后记录生长情况，并统计增殖系数。

1.2.4 生根培养

待继代培养中试管苗生长至4～10 cm时，将＞4 cm的新枝接入生根培养基。试验以1/2DKW为基本培养基，设置不同浓度的NAA（0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L），共6个处理，每个处理15瓶，每瓶接种2株试管苗，3次重复。50 d后统计其生根率及根长。

1.2.5 试管苗的移栽

试管苗生根后，将生根苗的瓶盖拧开但不敞开，于光照强度3 500 lx下炼苗7 d，取出小苗后，洗净根部培养基，将生根的试管苗移植于含有蛭石∶珍珠岩∶草炭（1∶1∶1）和（1∶2∶1）两种不同配比的基质中，同时设置两种不同消毒方式，硫酸亚铁溶液和高压灭菌（121℃下30 min），1月后统计成活率和生长情况。移栽后加盖透光塑料罩，每隔2 d检查一次，及时喷施多菌灵，2周后去掉塑料罩，1.5月后移栽至大田。

1.2.6 培养条件

试验所用培养基含琼脂6.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH5.8～6.5。培养基用100 mL的三角瓶分装，每瓶30 mL，用封口膜包扎，在121℃条件下用高压蒸汽灭菌锅灭菌20 min。培养温度为25±2℃，光照2 000～2 500 lx，每日光照时间为14 h/d。

1.3 统计分析

试验数据使用SPSS软件进行数据统计，采用邓肯氏新复极差法(SSR) 进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂及消毒时间对外植体污染的影响

本试验选用次氯酸钠溶液和次氯酸钙溶液两种消毒剂，对水培出新梢进行消毒处理，接种15 d后得到以下试验结果。

表1 不同消毒剂及消毒时间对外植体污染率和成活率的影响†Table 1 Effects of different disinfectants and disinfection time on contamination rate and survival rate of the explants

从表1可以看出，两种消毒剂均有良好的消毒效果。其中2%次氯酸钠消毒15 min效果最好，污染率达到4.4%，存活率95.6%，处理2、3、5的存活率均显著高于处理1、4、6；消毒10 min时污染率最高，其中大部分为黄、黑色霉菌污染，也有一些细菌污染，白色或粉色脓液。使用10%次氯酸钙消毒剂处理中，效果最好的是消毒12 min，污染率6.7%，存活率93.3%。

2.2 不同基本培养基对试管苗生长的影响

试验采用MS、1/2MS、WPM、DKW4种基本培养基，一个月后观察发现基本培养基对试管苗生长的影响差异比较显著，具体见表2。

表2 不同基本培养基对试管苗生长的影响Table 2 Effects of different basic medium on the growth of plantlets

试验发现四种基本培养基均能诱导芽分化，但在1/2MS、MS、WPM基本培养基上，均出现叶片接触培养基，与透明培养基接触点处变紫，同时叶片本身也出现不同程度褐化的情况。严重的如MS培养基，如果不及时剪去接触培养基的叶片，则可能会导致茎段褐化致死。在DKW培养基上，基本没有出现以上情况，且生长和分化良好，同时叶片健康舒展，整体健壮，适试管苗长期生长。

2.3 不同生长调节剂及配比对腋芽增殖的影响

以DKW为最适培养基，进行6-BA、NAA、GA3的不同浓度配比试验，其增殖情况不同（见表3）。

表3 不同生长调节剂及配比对腋芽增殖的影响Table 3 Effects of plant growth regulators and concentration on plantlet proliferation

试验结果发现，除4号处理外，处理5～12添加GA3后，平均苗高均大于对应生长调节剂组合的不添加GA3的1～4处理，最高可达6.22 cm，而未添加GA3最低仅1.34 cm，说明GA3能促进茎的伸长。从增值系数来看，处理3的增殖系数显著高于其他处理，高达17.89，最低的增殖系数为处理2为3.67，整体增殖系数高于同科同属的其他树种。综合增殖系数和平均苗高，均显著高于其他处理的为处理8，培养基为DKW+6-BA 0.5 mg/L +NAA0.2 mg/L+ GA30.5 mg/L，增殖系数15.56，平均苗高达到6.22 cm。

2.4 不同生长调节剂浓度对试管苗生根的影响

将生长健壮、苗高4.0 cm以上的高枝切下，接种于1/2DKW培养基上培养。大约10 d左右开始生根，50 d后对生根率等数据进行统计，长势情况见图1，生根结果如表4。

表4 不同生长调节剂浓度对生根的影响Table 4 Effects of plant growth regulators on plantlet rooting

结果表明，NAA能促进毛梾试管苗生根，但不同浓度的NAA对生根影响效果差异显著。以0.15 mg/L或0.2 mg/L的生根率最高，分别为69%和62%，整体来看，生根率随NAA浓度的升高而升高，但当浓度到达一定程度后，生根率随浓度升高而下降，试验发现NAA浓度过高易导致愈伤组织膨大，生根率下降，且会出现根畸形膨大等现象。从平均根数和平均根长来看，0.2 mg/L的NAA效果最好，平均根数6.5，平均根长2.9 cm，显著高于其他处理。低浓度NAA的处理效果不好，如NAA0.02 mg/L生根率、平均根数、平均根长均显著低于高浓度的处理。故建议生根培养基选择1/2DKW+NAA0.2 mg/L。

2.5 不同消毒方式和基质配比对移苗成活率的影响

炼苗后，将生根的试管苗移入不同消毒方式和不同配比的基质中，1月后结果如表5。

表5 不同基质配比和消毒方式对移苗成活率的影响Table 5 Effects of different ratio substrates and disinfection methods on the survival rate of transplanting

在相同驯化条件和基质配比条件下，硫酸亚铁溶液消毒的处理成活率仅12.2%，移栽4 d开始出现霉菌，极大的影响试管苗的生长，导致其大面积死亡；但经过高压灭菌的基质处理成活率高达94.4%，几乎没有污染现象，长势良好。同时发现两种不同配比的基质，毛梾试管苗的成活率差异显著，蛭石：珍珠岩：草炭1∶2∶1的基质成活率高达94.44%，而珍珠岩比例较少的蛭石：珍珠岩∶草炭1∶1∶1组合则成活率仅41.1%，说明基质透气性对移栽成活率影响很大。故建议在移栽毛梾试管苗时，选用经过高压灭菌后的蛭石∶珍珠岩∶草炭1∶2∶1基质，能保证较高成活率且长势良好。

3 结论与讨论

经过初步试验和张丹的研究结果，毛梾在消毒过程中，由于其叶片和茎段上有大量绒毛，污染率很高，常采用剧毒性药剂氯化汞进行消毒灭菌，并且出现褐化率高、产生毒害的现象[11]。许多研究表明，外植体的取材时间会影响其消毒的效果[12-13]。本试验采用初春将要萌动前毛梾结果枝，室内水培新梢作为外植体，其表面和内部细菌数量很少，相对于室外采回的外植体可以极大的降低污染率[14]，保存率高达96.7%，相比于张丹污染率42.5%[11]的研究结果有了进一步提升，同时选用低毒性消毒剂可降低其对外植体的毒害作用[12]，本试验外植体也几乎没有褐化现象，建议采用2%次氯酸钠消毒剂消毒15 min。

图1 毛梾试管苗生根及移栽情况Fig.1 Subculture, rooting and transplanting of plantlets of Cornus walteri Wanger

本试验得到的最适毛梾生长的基本培养基是DKW培养基。许多研究表明，DKW、WPM适用于木本植物的组织培养，比如蓝莓、阿月浑子、榛子、光皮树、梨等[8,15-19]，故本试验在张丹选用的MS、1/2MS、WPM3种基本培养基[20]基础上，另选用DKW培养基进行试验，结果表明MS培养基仍有褐化问题，DKW培养基效果更为理想。

植物器官的分化受生长素和细胞分裂素两类激素控制，而添加植物生长调节剂会引起内源激素的配比及水平发生变化，从而进一步调控培养物的分化及生长[21-22]。在继代培养中毛梾试管苗出现茎段节间短且矮小的现象，影响增殖生长。赤霉素GA3的生理作用是诱导茎的细胞伸长和形成层的细胞分化，并能刺激不定胚发育成小植株[23]。故加入适宜浓度的GA3，能促进茎伸长，试验结果与灯台树、樱花、茶树等其他木本植物研究结果一致[24-26]。继代培养采用DKW+6-BA 0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L+GA30.5 mg/L为宜，增殖系数为15.56，平均苗高达到6.2 cm。1/2DKW+NAA0.2 mg/L为最适生根培养基，生根率为62%。

移栽过程中，试管苗不仅要经受基质的变化，还要经历从无菌环境到有菌环境的过渡。故对基质的高压灭菌处理能更好保障试管苗的瓶外生长环境，并且用塑料罩方式逐步增强试管苗的抗性，可以帮助其顺利经过移栽过渡期。不同配比的基质具有不同的保水透气性[27]，本研究发现毛梾试管苗更需要透气的基质，后期观察发现在蛭石∶珍珠岩∶草炭1∶2∶1基质中生长的试管苗长势更好，苗高较高。

选择优质的繁殖材料才能得到优质的繁殖体[28]，母树的性状好坏决定了其生产的试管苗在田间的性状表现。作为果用的油料树种毛梾，选择母树的标准需要为已经进入结果期，结果量和品质均优的树木，并且选用连续稳产的枝条，这样才能保证生产出的试管苗具有同样的结果习性，以期望移栽至大田的试管苗能快速进入结果期，实现良种的快速繁殖[29]，达到早日结果实现丰产的目的。本试验坚持以上原则进行组培试验，但试管苗生根的机理有待进一步研究；炼苗和后期水肥管理对试管苗生长有很大影响[30]，移栽后的生长情况有待继续观察研究。

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Establishment of tissue culture system for improved clones in Cornus walteri Wanger.

BAO Tian, SU Shu-chai, GAO He, CHEN Yifan
(Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

In recent years, as one of prior utilized plants for biological fuel oil and energy substitute, Cornus walteri Wanger. oil value has been gradually developed and utilized. The traditional seed reproduction or asexual reproduction is dif fi cult to meet the needs of the short term to provide a large number of seedlings, due to the limited superior individual plant materials, so a rapid tissue culture system is necessary. The current research on Cornus walteri Wanger. only to primary culture, with the problem of high pollution rate and low induction rate, so it can not be applied in production. This experiment was conducted to investigate in vitro micropropagation of Cornus walteri Wanger. with the apical buds excised from the growing shoots of annual branches. The results showed that using 2%sodium hypochlorite for 15 min disinfection effect is best, contamination rate of 4.4%. The optimum basic culture medium for initial culture was DKW. The best generational culture medium was DKW with 6-BA 0.5 mg/L, NAA 0.2 mg/L and GA30.5 mg/L, the average proliferation coef fi cients was 15.56, average seedling height was 6.2 cm. The suitable rooting basic medium was 1/2DKW with NAA 0.2 mg/L, rooting rate 62%(the highest was 74%), the average root number was 6.5, the average root length was 2.9 cm. The medium with the ratio of 1:2:1 between vermiculite, perlite and peat soil was the most suitable for seedling transplanting, 94.4% of the plantlets survived.

Cornus walteri Wanger.; tissue culture; rooting

S722.3+7

A

1673-923X(2017)06-0070-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.06.012

2016-10-04

中央高校基本科研业务费专项资金资助（2015ZCQ-LX-02）

暴 甜，硕士研究生

苏淑钗，教授，博士生导师；E-mail：sushuchai@sohu.com

暴 甜，苏淑钗，高 赫，等. 毛梾优良无性系组培体系建立[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(6): 70-74, 95.

[本文编校：吴 彬]