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(烟台工程职业技术学院,山东烟台 264006)

周璐,成艳娜

(烟台工程职业技术学院,山东烟台 264006)

本文对苹果汁中45种有机磷类农药的提取、净化技术和气相色谱质谱检测条件进行了研究。以苹果汁为基质材料,45种有机磷类农药在1、5、10 μg/L三个水平上对苹果汁进行添加回收率实验。结果表明:45种有机磷类目标物在优化条件下的回收率为71.16%～117.94%,相对标准偏差1.20%～15.13%(n=5),方法检出限为0.01～0.22 μg/L。45种有机磷类农药能够实现很好的分离,线性范围在10～2000 μg/L,线性相关系数大于0.984。本方法操作简单,结果准确,由于几乎不使用有机溶剂也减少了分析过程对环境和人体的危害。

浊点萃取,反萃取,气相色谱质谱法,有机磷类农药

我国是农药产量和使用大国,有机磷类占了农药总数量的大半。有机磷残留不仅可以通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害,同时也造成一定的环境污染。国内外对于有机磷类农药残留的分析报道中,检测方法主要为气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、免疫法、酶抑制法等[1-5]。其中,用于检测前的样品前处理技术多为固相萃取柱净化、凝胶渗透色谱净化、液液萃取、加速溶剂萃取及分散固相萃取等[6-10]。这些方法大都操作时间长,有机溶剂用量大,对环境和人体有一定危害。

浊点萃取技术是一种近几年新兴的环保样品前处理技术,以表面活性剂水溶液为萃取剂,避免使用有机溶剂提取,通过表面活性剂的增溶性和分相来实现对目标物的分离和富集,最后用微量的有机溶剂将目标物从表面活性剂相中反萃取出来,从而更大的提高了此方法的富集倍数,还可避免表面活性剂粘度较大对检测仪器的影响。此项技术已广泛应用于金属离子、生物大分子、临床治疗药物检测、体内微量元素、有毒污染物及中药成分等样品的分离分析预处理[11-12],但是关于浊点萃取反萃取法同时富集分离果汁中几十种有机磷类农药的研究极少。本文采用的方法具有操作简便快捷、经济环保、无需特殊设备等优点。前处理过程几乎不使用有机溶剂,适用于大批量分析,为保证食品安全和减少分析方法对环境和人体的危害提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果汁 为市售汇源100%纯苹果汁。敌敌畏、乙酰甲胺磷、丙线磷、硫线磷、甲拌磷、甲基乙拌磷、乐果、烯虫磷、特丁硫磷、杀螟腈、地虫硫磷、二嗪磷、乙拌磷、氯唑磷、乙嘧硫磷、安果、磷铵、除线磷、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、甲基立枯磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、甲基溴硫磷、异柳磷、毒虫畏、喹硫磷、稻丰散、丙虫磷、乙基溴硫磷、抑草磷、丙硫磷、丙溴磷、乙硫磷、三唑磷、硫丙磷、三硫磷、苯腈磷、敌瘟磷、苯硫磷、付杀硫磷 均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000、正丁醇、无水硫酸钠、正己烷、异辛烷、石油醚 天津博迪化工股份有限公司试剂。

QL-886漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器有限公司;Agilent 7890A/5975C气相色谱质谱仪 美国安捷伦公司;AS3120超声仪 中西远大科技有限公司;FA2004电子天平(0.0001 g) 上海天平仪器厂;彩色单道移液枪 美国瑞宁仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 农药标准溶液的配制 分别取适量的45种有机磷类农药标准品,用正己烷-丙酮(7∶3,v/v)定容配制成质量浓度100 mg/L的标准溶液,再用正己烷-丙酮(7∶3,v/v)逐级稀释成2、0.5、0.1、0.02、0.01 mg/L的混合标准储备液,于4 ℃下保存。

1.2.2 样品前处理技术 准确移取10.0 mL苹果汁于15 mL刻度试管中,依次准确加入3.0 mL 300 g/L PEG 4000溶液、1.10 g无水硫酸钠,混合均匀并超声辅助全部溶解后,准确加入0.4 mL正丁醇,混合均匀。将上述混合溶液于60 ℃条件下水浴20 min。待其降至室温后移取下层水相弃去。向刻度试管中剩下的表面活性剂相中准确加入250 μL正己烷,漩涡混合1 min,待其分层后吸取上层正己烷相移至自动进样小瓶,待测。

1.2.3 GC-MS分析条件 4 Agilent 7890A/5975C气相色谱仪,VG Trio-2000质谱检测器;色谱柱:HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序为:70 ℃(保持2 min)以25 ℃/min的速度升至145 ℃,再以3 ℃/min的速度升至200 ℃,以8 ℃/min的速度升至280 ℃(保持5 min);在SIM模式下检测,采用电子轰击源(EI+);电压为70 eV;离子源温度为230 ℃;流速:1 mL/min;载气:氦气(纯度99.999%);进样量:1 μL。

1.2.4 方法检出限的测定 在空白样品中添加标准溶液进行检测,以三倍信噪比(S/N=3)对应的浓度为方法检出限。

2 结果与分析

2.1 浊点萃取条件优化

浊点萃取的操作过程是在样品液中加入表面活性剂溶液、无机盐、醇类及其他成分,混合均匀,然后将混合液在适当的温度下平衡一段时间,待混合溶液中两相完全分离后,弃去水相,富集后的表面活性剂相适当处理后待分析[13-14]。

前处理过程中,表面活性剂的种类及其用量、添加剂的用量、平衡温度及平衡时间是影响萃取效果的几个最主要因素。其中表面活性剂的种类及用量直接决定了目标药物的有效提取率,关系着检测结果的准确性。同时这几个参数又互相影响,只有全部优化了这几个参数才能得到理想的富集、净化效果和回收率。

2.1.1 表面活性剂种类的选择 浊点萃取效率直接受表面活性剂疏水和亲水两部分的影响。同时各种表面活性剂都有一定的适用对象,本实验选择4种HLB值不同且能与反萃取溶剂正己烷分层的表面活性剂(PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000)作为优化对象进行研究。PEG 2000需要的水浴温度过高(超过60 ℃),因而重点对PEG 4000、PEG 6000和PEG 8000进行比较,结果PEG 4000的回收率范围是69.6%～119.4%,PEG 6000的回收率范围是65.9%～121.7%,PEG 8000的回收率范围是64.8%～124.1%。由图1可以看出,PEG 4000作为浊点萃取的表面活性剂时添加回收率接近100%的农药种类最多。

图1 表面活性剂种类对目标物回收率的影响Fig.1 Effect of types of surfactant on recovery

2.1.2 表面活性剂用量的选择 表面活性剂的用量显著影响回收率、浓缩因子、相比等参数。用量少会出现回收率低、准确度和重现性欠佳等问题,严重影响实验定量研究。用量过多,也可能出现回收率降低的现象,同时会在进样过程中产生负面影响,如目标物保留时间发生变化等[15]。

因此本实验在PEG 4000的浓度为300 g/L时进行研究。PEG 4000浓度太高时溶液粘稠不利于吸取转移;浓度太低需要的体积过大时会降低富集倍数。当PEG 4000添加量为2.5 mL时回收率范围是65.9%～116.2%,添加量为3.0 mL时回收率范围是73.4%～118.3%,添加量为3.5 mL时回收率范围是69.1%～123.5%。结果如图2所示,当PEG 4000添加量为3.0 mL时45种有机磷的回收率接近100%的数量最多,能够满足农药残留分析的要求。

图2 PEG 4000用量对目标物回收率的影响Fig.2 Effect of concentration of PEG 4000 on recovery

2.1.3 正丁醇量的优化 萃取过程中加入适当的添加剂可以改变表面活性剂的浊点温度,引发表面活性剂的相分离。本研究中,正丁醇的添加量对45种有机磷类农药的回收率有一定的影响。在300～450 μL范围内对正丁醇的用量进行优化。当正丁醇添加量为300 μL时回收率范围是65.6%～111.4%,添加量为350 μL时回收率范围是66.9%～117.2%,添加量为400 μL时回收率范围是74.9%～113.6%,添加量为450 μL时回收率范围是72.5%～119.7%。结果表明:正丁醇的添加量为400 μL时,回收率接近100%的农药种类最多。

图3 正丁醇用量对目标物回收率的影响Fig.3 Effect of the volume n-butyl alcohol on recovery

2.1.4 盐种类及用量的优化 添加惰性盐于溶液中可以增大溶液离子强度,使水相密度增大,加速两相分离;降低表面活性剂的浊点温度,还可以增加目标物的回收率。

本实验经初步预选后使用无水Na2SO4和无水MgSO4进行添加回收率实验。由图4可以看出,在添加量相同的条件下,添加无水Na2SO4比添加无水MgSO4时农药的平均回收率接近100%的数量多且较稳定,选择无水Na2SO4做进一步用量优化实验。考察了0.9～1.2 g无水硫酸钠的添加量对浊点萃取的影响。结果表明:1.10 g无水硫酸钠的添加量回收率最理想(图5)。

图4 盐的种类对目标物回收率的影响Fig.4 Effect of the salt type on recovery

图5 无水硫酸钠的添加量对目标物回收率的影响Fig.5 Effect of the mass of sodium sulfate anhydrous on recovery

2.1.5 平衡温度的优化 采用非离子表面活性剂萃取目标物时,提高平衡温度会导致非离子表面活性剂与水作用的氢键破坏而发生脱水现象,从而使萃取率增加,富集相体积减小[13]。通常,采用的平衡温度高于浊点以上15～20 ℃。由此本实验在50～70 ℃范围内对平衡温度进行优化,图6为当表面活性剂为PEG 4000,其浓度为300 g/L,正丁醇添加量为0.4 mL,无水硫酸钠添加量为1.1 g时,平衡温度对目标物回收率的影响情况。实验结果显示:在60 ℃时,45种有机磷类农药的回收率接近100%的种类最多。

图6 平衡温度对目标物回收率的影响Fig.6 Effect of equilibration temperature on recovery

2.1.6 平衡时间的优化 浊点萃取中存在表面活性剂、单体和待测物在水相、胶束相两个平衡过程,这两个过程都需要一定的时间达到平衡。前者平衡时间与环境温度又有密切关系[14]。由此本实验在10～40 min范围内对平衡时间进行优化。图7为当表面活性剂为PEG 4000,其浓度为300 g/L,正丁醇添加量为0.4 mL,无水硫酸钠添加量为1.1 g时,平衡温度为60 ℃时,平衡时间对目标物回收率的影响。实验结果表明:平衡20 min,45种有机磷类农药的回收率接近100%的种类最多。因此,选择20 min作为最优平衡温度来进一步完成实验研究。

图7 平衡时间对目标物回收率的影响Fig.7 Effect of time on recovery

2.2 反萃取条件优化

2.2.1 反萃取溶剂的选择 为增加萃取富集率,降低检出限数值。本实验考虑采用既能与水相分层又对有机磷有较高溶解度的二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、异辛烷、石油醚作为反萃取溶剂。由于二氯甲烷萃取后在下层不利于吸取进样,乙酸乙酯与表面活性剂相不分层,故先排除这两种溶剂。用正己烷、异辛烷、石油醚做添加回收率实验,结果表明:正己烷的平均回收率接近100%的农药种类最多且符合农残分析要求(图8)。

图8 反萃溶剂的选择Fig.8 The type of reverse extraction solvent

表1 标准溶液的线性范围、线性方程、相关系数和检出限Table 1 Linear range,linear equations,correlation coefficients and LOD for the standard mixture of pesticides

2.2.2 反萃取溶剂用量的选择 考察正己烷体积对回收率的影响,当正己烷体积低于200 μL时,虽然富集倍数较高但由于体积小会给操作带来不便,容易吸取到表面活性剂层进样后会对仪器造成损伤;当体积过大时被测组分的富集倍数会越小[15]。故在200～350 μL范围内考察正己烷用量对回收率的影响,根据回收率接近100%的农药种类数量最终确定正己烷的用量为250 μL(图9)。

图9 正己烷用量的选择Fig.9 The concentration of n-hexane

2.3 方法的灵敏度和精密度

将45种有机磷农药配制成2000、500、100、20、10 μg/L的混合标准溶液按上述优化好的CPE-GC/MS法,检测得到线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限,如表1。

续表

表2 45种有机磷类农药的添加回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Spiked,recovery and precision(n=5)

续表

在1、5、10 μg/L三个水平上进行添加回收率实验,每一添加水平重复5次实验,外标法定量。利用空白样品标定校正计算的回收率和相对标准偏差见表2,表明该方法有良好的精密度和准确度,能够达到痕量分析的要求。在优化的色谱及质谱条件下45种有机磷类农药能够得到很好的分离,峰形良好。45种农药标准物质的总离子流图见图10。当样品的添加水平为5 μg/L时,45种有机磷类农药的总离子流色谱图见图11。

图10 45种有机磷类农药标准物质的总离子流色谱图 Fig.10 GC-MS total ion current chromatograms of the mixed standard solution of 45 organophosphorous pesticides注:标准溶液浓度为0.5 mg/L。

图11 样品中45种有机磷类农药的总离子流色谱图Fig.11 GC-MS total ion current chromatograms of 45 organophosphorous pesticides 注:添加水平为5 μg/L。

3 结论

本实验选择苹果汁为供试样品,45种广泛使用的有机磷类农药(敌敌畏、甲拌磷、乐果等)为待测农药,通过前处理条件的优化建立了浊点萃取-正己烷反萃取气相色谱质谱联用法分析检测苹果汁中有机磷类农药的技术。确定了以300 g/L PEG 4000水溶液为萃取剂,无水硫酸钠、正丁醇的添加量为1.10 g和400 μL,平衡温度和时间为60 ℃和20 min的浊点萃取因素。反萃取溶剂选择正己烷,用量为250 μL。利用此技术在1、5、10 μg/L三个水平上对供试苹果汁进行添加回收率实验,实验结果表明:45种有机磷类目标物在优化条件下的回收率为71.16%～117.94%,相对标准偏差1.20%～15.13%,实验操作简单,结果准确,精密度高。在10～2000 μg/L范围内,45种有机磷类农药线性关系良好,相关系数均大于0.984;LOD值为0.01～0.22 μg/L,均低于国家规定最大残留限量标准和日本肯定列表中农作物种农药残留的一律标准(10 μg/L)的限量要求[16],同时45种有机磷类农药得到了很好的分离,峰型对称,避开了苹果汁中杂质的干扰。本方法简化了样品的前处理的步骤,节约了分析时间,灵敏、高效,适用于大批量分析,且极少使用有机溶剂,经济环保。采用反萃取操作后将农药的富集率从3.3倍提升到40倍,降低了检出限。本方法为保证食品安全,减少对环境和人体的危害提供了技术保障,且适用广泛。

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DeterminationoforganophosphorouspesticidesinciderbyGC-MScoupledwithcloudpointextraction

ZHOULu,CHENGYan-na

(Yantai Engineering and Technology College,Yantai 264006,China)

This article focused on the technique using GC-MS to determine the presence and concentrations of 45 kinds of organophosphorous pesticides in cider. 45 pesticides were tested with the recovery experiment of cider at three levels:1,5,10 μg/L.The results showed that the 45 pesticides gave satisfactory recoveries ranging from 71.16% to 117.94% with the RSDs from 1.20% to 15.13%(n=5),the limitation of this method was between 0.01 μg/L and 0.22 μg/L. 45 pesticides were well separated and the linear relationship was good enough which the correlation coefficients were greater than 0.984 for concentrations from 10 to 2000 μg/L for most pesticides. Compared with conventional techniques,it was more accurate,low-cost,highly efficient and environmental friendly. Furthermore,for the limited use of organic solution,it has little harm to environment and human’s health for the limited use of organic solution during the analysis process.

cloud point extraction;back-extraction;gas chromatography-mass spectrometer;organophosphorus pesticides

2017-06-12

周璐(1986-)，女，硕士，研究方向：食品营养与检测，E-mail:297371859@qq.com。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0225-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.042