, ,, ,,*

(1.中国动物疫病预防控制中心,北京 102609;2.中国标准化协会,北京 100048)

刘洪斌1,李颖1,姚喜梅2,于雷1,蔡英华1,*

(1.中国动物疫病预防控制中心,北京 102609;2.中国标准化协会,北京 100048)

采用超高效液相色谱串联质谱建立羊奶及奶粉中吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克伦普罗、奥达特罗等27种β-受体激动剂类药物残留检测方法。样品经过1%甲酸乙腈提取、Oasis PRiME HLB柱净化后,经Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分离,以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,多通道MRM信号采集模式,27种β-受体激动剂类药物能在10.5 min内出峰完好,在1.0～100.0 μg/L浓度范围内,27种β-受体激动剂类药物线性良好,相关系数均在0.993以上;羊奶中最低定量限均低于0.5 μg/kg,通过0.5、2.5、5.0 μg/kg三个浓度的加标回收实验表明,回收率为65.7%～119%,批内变异系数为0.79%～10.4%,批间变异系数为2.13%～15.7%。奶粉中最低定量限均低于2.0 μg/kg,通过2.0、10.0、20.0 μg/kg三个浓度的加标回收实验表明,回收率为60.5%～109%,批内变异系数为1.91%～12.4%,批间变异系数为3.06%～17.2%。所建立方法为一种高通量检测羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物残留确证分析方法。

羊奶,奶粉,β-受体激动剂类,残留,UPLC-MS/MS

羊奶在国际营养学界被称为“奶中之王”,相比牛奶,羊奶脂肪粒和蛋白微粒小,更容易被人体吸收,羊奶酪蛋白含量比牛奶低,乳清蛋白比例高,更接近于人奶,更适合婴幼儿食用,同时异体蛋白含量也较少,对牛奶过敏和体质较弱的人群更适合选用羊奶[1]。随着消费水平的提高,越来越多的消费者倾向于营养价值更高的羊奶及奶制品,但随着近年来我国畜产品例行监测发现羊肉中β-受体激动剂类药物的不断检出,羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物残留的风险越来越大,对婴幼儿及体弱人群身体健康造成潜在威胁。

现行国标GB/T22965-2008未包含羊奶和奶粉中β-受体激动剂类药物检测方法,目前检测β-受体激动剂类药物方法文献较多,近年来检测方法有毛细管电泳法[2]、气相色谱质谱联用法[3]、飞行时间质谱法[4]和液相色谱质谱联用法[5-6]等,尤其液质联用方法较多;动物源性基质大多为动物组织,尿液和牛奶等[7-12],且检测新型β-受体激动剂药物种类少,而同时检测羊奶及奶粉中包括吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克伦普罗、奥达特罗等27种β-受体激动剂类药物的检测方法还未见报道,因此建立同时检测羊奶及奶粉中多种β-受体激动剂类药物残留定量方法势在必行。

本文采用超高效液相串联质谱建立的羊奶及奶粉中27种β-受体激动剂类药物检测方法,具有药物种类多、操作简单、灵敏度高,稳定性好的优点,并通过已知阳性样品验证,方法满足羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物残留检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奥西那林(CAS:586-06-1)、西马特罗(CAS:54239-37-1)、特布他林(CAS:23031-25-6)、沙丁胺醇(CAS:242-424-0)、齐帕特罗(CAS:117827-79-9)、西布特罗(CAS:54239-39-3)、吡布特罗(CAS:38677-81-5)、羟苄羟麻黄碱(CAS:26652-09-5)、丙卡特罗(CAS:72332-33-3)、非诺特罗(CAS:13392-18-2)、瑞普特罗(CAS:54063-54-6)、羟甲基克伦特罗(CAS:38339-18-3)、克仑塞罗(CAS:157877-79-7)、克伦普罗(CAS:38339-11-6)、氯丙那林(CAS:3811-25-4)、克仑特罗(CAS:37148-27-9)、莱克多巴胺(CAS:97825-25-7)、妥布特罗(CAS:41570-61-0)、美托洛尔(CAS:37350-58-6)、马布特罗(CAS:56341-08-3)、马喷特罗(CAS:54238-51-6)、福莫特罗(CAS:73573-87-2)、溴布特罗(CAS:41937-02-4)、班布特罗(CAS:81732-65-2)、奥达特罗(CAS:868049-49-4)、喷布特罗(CAS:38363-32-5)、苯乙醇胺A(CAS:1346746-81-3) 购于德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均在97%以上;乙腈、甲醇、甲酸等有机溶剂均为色谱纯 美国Fisher公司;Waters Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg,3 cc) 美国waters公司。

用甲醇将上述标准品配制单标母液,并配制10 μg/mL混合储备液于-20 ℃保存(保存期限3个月),使用时现配成系列标准工作液;

样本原料:10份羊奶及5份奶粉购于超市和电商,部分样本经LC-MS/MS分析确认为不含待测物的阴性样本作空白添加实验使用;实验室原有含β-受体激动剂类药物羊奶样为阳性测试样本。

超高效液相色谱仪(Acquity UPLC)配三重四级杆质谱仪(quattro premier XE)、3K15型离心机、millipore纯水仪。

1.2 实验方法

1.2.1 前处理过程 羊奶样品提取:准确称取2 g(精确到0.01 g)羊奶于50 mL离心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,然后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min离心5 min取上清液于15 mL离心管中,待过净化柱。

奶粉样品提取:准确称取5 g(精确到0.01 g)奶粉样品,加入适量水溶解,并最终定容于20 mL,充分混匀后,准确称取2 mL羊奶于50 mL离心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min离心5 min取上清液于15 mL离心管中,待过净化柱。

净化:将提取液全部转移至80%乙腈水活化的Oasis PRiME HLB柱中,流速1～2 d/s,收集全部滤过液,50 ℃氮气吹至近干,用初始流动相定容至1 mL,12000 r/min离心5 min,0.22 μm滤膜过滤待上机测定。

1.2.2 液相条件 色谱柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速:0.3 mL/min;流动相A:甲醇,B:0.1%甲酸水溶液,0～0.5 min,3% A保持不变,0.5～2.0 min,3% A线性变化至25%;2.0～3.5 min,25% A保持不变,3.5～3.6 min,25% A线性变化至40%;3.6～4.0 min,40% A保持不变;4.0～5.5 min,40% A线性变化至90%;5.5～8.0 min,90% A保持不变;8.0～8.1 min,90% A线性变化至3%,8.1～10.5 min,3% A保持不变。

1.2.3 质谱条件 电离模式:ESI+;毛细管电压:3.5 kV;萃取锥孔电压:3 V;RF透镜电压:0.5 V;源温:110 ℃;脱溶剂温度:350 ℃;锥孔气流速:50 L/h;脱溶剂气流速:550 L/h;碰撞气流速:0.17 mL/min;采集模式:多通道MRM。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 线性方程及灵敏度 实验采用空白羊奶及奶粉样品经1.2.1方法处理,在1.0～100.0 μg/L浓度范围内分别添加β-受体激动剂类药物混标溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基质加标溶液,依次进样,以色谱峰面积为纵坐标,化合物浓度为横坐标做标准曲线;将处理好的空白羊奶及奶粉样品逐级稀释标准溶液,按10倍信噪比确定方法的定量限(LOQ)。

1.2.4.2 回收率实验及变异系数 取空白羊奶样品,添加浓度为0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三个水平混标溶液,批内6次平行,按1.2.1方法进行添加回收实验;在不同日期重复测定3个批次,计算日内变异系数与日间变异系数。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

通过文献[13]对比实验发现,β-受体激动剂类化合物碎片离子和丢失离子存在一定共性,其中羟甲基克伦特罗、克仑塞罗、克伦普罗和克仑特罗具有相同的碎片离子m/z 202.9,推测是各自准分子离子峰[M+H]+,脱去H2O分子后,经结构重排失去(2-甲基丙烯)得到的特征碎片;而沙丁胺醇、西布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克伦普罗等丢失离子普遍为m/z 60.2、m/z 18.0、m/z 74.3分别为脱H2O+丙烯峰、脱H2O峰和脱H2O+2-甲基丙烯峰;依据欧盟2002/957/EC决议中关于质谱分析法定性定量不少于4分的规定,选择强度较高的两对子离子,并优化碰撞电压使其相应强度最佳,各种药物优化母离子和子离子及对应聚焦电压和碰撞电压值见表1。

表1 27种β-受体激动剂类药物的检测离子、对应质谱参数及保留时间Table 1 Qualitative ions,quantitative Ions* and relevant parameters of β-agonists

续表

注:*为表示定量离子。

由于同时分析药物较多,单一MRM通道无法满足灵敏度和准确度要求,因此采用分时段多通道MRM模式,并对驻留时间进行优化,使各通道驻留时间在0.005～0.05 ms之间,保证各色谱峰上都能达到10～12个数据采集点,确保每种化合物都能得到较高的灵敏度和准确定量。

2.2 液相条件优化

本文采用甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相,选择Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Shield RP18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)进行实验,结果表明,多种β-受体激动剂类化合物在50 mm色谱柱上,出峰时间集中在2～4 min。由于相对保留时间过于集中造成色谱峰上采集点数过少,严重影响目标化合物的灵敏度,而后两种100 mm色谱柱中,BEH C18类型色谱柱下,各物质更为分离完全,峰形更好,且能避免莱克多巴胺出峰分叉的问题。

2.3 提取条件优化

国标方法及文献[14-16]中,样本中某些β-受体激动剂类药物易和动物体内葡萄糖醛酸结合,造成提取回收率低的现象,因此将通过空白羊奶样品添加20 μg/kgβ-受体激动剂类混合标准溶液,经过37 ℃酶解12 h。然后分别选取0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈和2%甲酸乙腈为提取溶剂处理猪肉样品,经UPLC-MS/MS检测发现:酸性有机试剂提取条件下,β-受体激动剂类药物大多能达到50%以上的回收率,并且不同的甲酸量对提取效果的影响不同,综合全部β-受体激动剂类药物回收率发现(图1)1%甲酸乙腈提取效果最好,27种β-受体激动剂类药物回收率均能达到60%以上。

图1 不同提取溶剂下提取回收率Fig.1 Recoveries were obtained by different extraction conditions

2.4 基质效应

羊奶因含有更多的营养物质和生物活性因子,增加了基质的复杂性,采用质谱进行定量分析时会存在不同程度和来源的基质效应[17-18],为评估基质效应的影响,本实验采取提取后添加法[19],为此按照1.2.1方法处理空白羊奶样本,然后添加20 μg/kg混合标准溶液制成基质加标溶液,设计基质效应对照实验,基质效应(ME)=标液在空白羊奶基质中峰面积/标液在纯溶剂中峰面积,若比值小于1.0,说明基质对待测物的响应产生抑制作用;若大于1.0,说明基质的存在增强效果;若等于1.0,说明待测物的响应未受影响。实验结果发现27种β-受体激动剂类药物在羊奶基质中均存在不同程度的基质抑制作用,ME分别为0.56～1.00之间,原因可能为前处理过程后,羊奶中脂类、糖类、可溶性蛋白等内源性杂质随目标化合物共流出,在电离过程中共流出物抑制目标化合物的离子化过程。因此在检测过程中应采用基质匹配标准溶液,消除基质效应的影响,不同药物基质抑制程度见图2。

图2 羊奶中基质效应图Fig.2 The figure of matrix effect in goat milk

2.5 线性方程及灵敏度实验

实验采用空白羊奶及奶粉样品经1.2.1方法处理,分别添加β-受体激动剂类药物混标溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基质匹配标准溶液,实验结果表明1.0～100.0 μg/L范围内线性良好,相关系数均大于0.993,结果见表2～表3。

将处理好的空白羊奶及奶粉样品逐级稀释标准溶液,按10倍信噪比确定方法的定量限(LOQ),羊奶中定量限在0.1～0.5 μg/kg,奶粉中该类药物定量限为0.5～2.0 μg/kg,结果见表2～表3。

2.6 回收率实验及变异系数

取空白羊奶样品,添加浓度为0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三个水平混标溶液,批内6次平行,不同时间重复测定3个批次,进行添加回收实验,添加5.0 μg/kgβ-受体激动剂类药物的羊奶样品定量离子图见图3,回收率在65.7%～119%,批内变异系数为0.79%～10.4%,批间变异系数为2.13%～15.7%(奶粉中回收率在60.5%～109%,RSD%值为1.91%～12.4%,批间变异系数为3.06%～17.2%)之间,方法的准确度及精密度满足 GB/T 27404-2008 技术要求,结果见表2。

表2 羊奶中27种β-受体激动剂类药物添加回收率、CV值、线性系数及定量限值(n=6)Table 2 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in goat milk(n=6)

表3 奶粉中27种β-受体激动剂类药物添加回收率、CV值、线性系数及定量限值(n=6)Table 3 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in powder(n=6)

2.7 实际样品检测

应用该方法对超市购买的10份羊奶样品、5份羊奶粉和实验室原有阳性羊奶样本进行测定,实验结果显示,购买的羊奶及奶粉样本中未检测到β-受体激动剂类药物残留,阳性样本检出沙丁胺醇含量为5.56 μg/kg,与原有结果5.82 μg/kg相比较,在结果偏差允许范围内。表明该方法适用于羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物检测。

3 结论

本实验通过对液相和质谱条件和前处理过程进行优化,建立了同时检测羊奶及奶粉样本中吡布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克伦普罗、奥达特罗等27种β-受体激动剂类药物的超高效色谱串联质谱方法,并对所建方法进行了方法学验证和实际样本检测,验证该方法满足羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物检测要求。该方法弥补了现有国标方法检测基质单一,检测药物种类少的缺点,对奶及奶粉中多种β-受体激动剂类药物同时确证检测、筛查和确证羊奶及奶粉中β-受体激动剂类药物残留以及相关标准制修订提供了参考,对监管羊奶及奶粉质量安全具有一定技术支撑作用。

图3 空白羊奶基质中添加5.0 μg/kg β-受体激动剂类药物色谱图Fig.3 The chromatograms obtained from blank goat milk spiked with 5.0 μg/kg of β-agonists

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Simultaneousdeterminationoftwenty-sevenβ-agonistsresiduesingoatmilkandpowderusingultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry

LIUHong-bin1,LIYing1,YAOXi-mei2,YULei1,CAIYing-hua1,*

(1.China Animal Disease Control Center,Beijing 102609,China;2.China Association for Standardization,Beijing 100048,China)

A multiresidue method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the determination of twenty-sevenβ-agonists(pyrbuterol,procaterol,reproterol,clenproperol,olodaterol. et al)residues in goat milk and powder. In this method,analytes were extracted by acidified acetonitrile,and purified by Oasis PRiME HLB SPE column. twenty-sevenβ-agonists were analyzed by Acquity UPLC BEH C18column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)using methanol and 0.1% formic acid as the mobile phases. The signals are acquired through the multi-channel MRM mode. All analytes could be well-separated by a gradient program during 10.5 minutes. The calibration curves of twenty-sevenβ-agonists were linear in a concentration range of 1.0～100.0 μg/L(r>0.993),and the limits of quantitation were all less than 0.5 μg/kg in goat milk. The recoveries of 0.5,2.5,5.0 μg/kg fortified samples ranged from 65.7%～119%,with the intra-assay coefficient of variation was 0.79%～10.4% and the inter-assay coefficient of variation was 2.13%～15.7%. The limits of quantitation were all less than 2.0 μg/kg in milk powder. The recoveries of 2.0,10.0,20.0 μg/kg fortified samples ranged from 60.5%～109%,with the intra-assay coefficient of variation was 1.91%～12.4% and the inter-assay coefficient of variation was 3.06%～17.2%. The method was established as a high-throughput method for confirmation ofβ-agonists residues in goat milk and powder.

goat milk;milk powder;β-agonists;residues;UPLC-MS/MS

2017-03-29

刘洪斌(1985-)，男，硕士，工程师，从事动物产品质量安全检测及风险评估方面的研究，E-mail:liuhongbin111@163.com。

*通讯作者:蔡英华(1977-)，男，本科，工程师，从事动物产品质量安全检测及风险评估方面的研究，E-mail:caiyh@163.com。

十二五国家科技支撑计划项目(2014BAD13B05)；兽药残留检测标准物质研制(2013FY113300-1)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0214-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.040