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(1.江西农业大学工学院,江西南昌 330045;2.江西省现代农业装备重点实验室，江西南昌 330045;3.江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌 330045;4.江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心，江西南昌 330045)

猪饲料中Cu元素的双脉冲激光诱导击穿光谱检测技术研究

刘珊珊1,2,张俊3,林思寒1,2,刘木华1,2,4,赖曲芳1,万仁杰1,黎静1,2,4*,梅宇1

(1.江西农业大学工学院,江西南昌 330045;2.江西省现代农业装备重点实验室，江西南昌 330045;3.江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌 330045;4.江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心，江西南昌 330045)

对猪饲料中Cu元素的双脉冲激光诱导击穿光谱(LIBS)检测技术进行了研究。结合正交实验设计对饲料样品中Cu元素进行了LIBS实验参数优化。根据正交实验的直观分析法中的指标之和得出最佳实验参数条件为:激光A能量157.77 mJ,激光B能量196.87 mJ,激光延迟时间450 ns,采集延时1.28 μs。基于偏最小二乘(PLS),比较了不同点数平滑处理和各种预处理方法对PLS模型预测效果的影响。最后得出,结合9点平滑预处理能有效降低噪声信号,能够提高PLS模型分析LIBS光谱数据的准确性,模型预测结果:相关系数r,预测均方差RMSEP,平均相对误差ARE分别为0.9879、15.10、8.24%。

激光诱导击穿光谱,猪饲料,铜元素,PLS

铜是猪生长发育所必需的微量元素之一,缺铜会引起机体免疫力下降、贫血及骨骼发育不完全等病症,导致生长缓慢。近年来,铜作为猪饲料的添加剂,普遍应用于猪养殖业[1]。高铜饲料可以促进生长激素的分泌,抑菌和增加体液等优势,凡事利弊两存,长期喂养高铜饲料容易导致机体中毒和营养失去平衡[2]。而且猪对铜的需求量是很小的,在实际饲养过程中,猪发生缺铜症的情况比较少见[3]。此外,饲料中超过90%的铜元素不能由动物自身粪便排出体外,造成资源浪费,对环境造成污染,通过食物链富集危及人类健康。畜禽粪便的农用已经成为土壤中铜的重要来源,铜在土壤中不易被降解,对植被的生长带来不利影响[4-5]。

重金属铜的检测常规方法有原子吸收光谱法[6-7]、分光光度法[8]、电感耦合等离子体-原子发射光谱法[9]和电感耦合等离子体-质谱分析法[10]等,这些常规方法虽然具有较高的检测精度和灵敏度,但是样品前处理过程过于繁琐、处理时间过长。激光诱导击穿光谱(Laser-Induced Breakdown Spectroscopy,LIBS)技术利用脉冲激光产生的等离子体烧蚀并激发样品中的物质,并通过分析光谱仪获取被等离子体激发的原子所发射的光谱来识别样品中的元素组成成分,进而可以进行物质的识别、分类、定性以及定量分析,具有无需复杂的样品预处理过程、分析时间快、操作简单及可实现快速、无损、多元素同时检测等优点。近年来,该项技术已被广泛应用于环境监测[11]、生物医疗[12]、水体污染[13]和土壤污染[14-15]等领域。

对于Cu元素的LIBS检测,王彩虹[16]经过简单的物理干燥方法后,LIBS有望通过采集干样光谱信息,辅助以各种光谱数据预处理及化学计量学分析方法,实现对新鲜脐橙样品中Cu元素的分布规律进行预测。陈钰琦[17]通过研究发现:利用内标法,可以消除双光束激光的几何构型和激光脉冲能量等实验参数对铜原子辐射信号的影响,从而可以采用正交双波长双脉冲激光剥离—激光诱导击穿光谱技术开展银饰品中铜杂质含量的定量分析。

偏最小二乘法(Partial Least Squares,PLS)是一种多元分析方法,利用一段光谱或所有数据点的全谱作为自变量与元素浓度作为因变量之间的关系分析,拟合光谱强度和元素浓度之间的关系,在一定程度上克服了传统单变量模型的缺点,它能够在自变量多重相关的条件下,有效地构造出对系统解释性最强的子空间,进行回归建模,使模型的精度和可靠性得到很大的提高[18-19]。

但是关于猪饲料中微量元素LIBS检测[20]的相关报道并不多见。本研究拟采用LIBS技术测定并对猪饲料中Cu元素进行PLS建模定量分析,为现代饲料中微量元素检测技术的发展提供了理论依据,也为饲料中其他金属的检测提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

饲料原料 豆粕、玉米、棉籽饼、麸皮、骨粉、食盐、维生素预混料、赖氨酸、大蒜素;分析纯五水硫酸铜(纯度≥99.0%) 西陇科学股份有限公司;优级纯硝酸(纯度65%～68%) 西陇化工有限公司;高氯酸(纯度70%) 山东西亚化学工业有限公司;120 mm培养皿 江苏省泰州市兆华贸易有限公司;超纯水。

400Y粉末粉碎机 铂欧五金厂;VORTEX-6涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;T69YP-15A手动压片机 天津市科器高新技术公司;SCIENTZ-50F冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TAS-986原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Vlite-200型的Nd:YAG双光束激光器 北京Beamtech公司;双通道光栅光谱仪 Avantes公司,荷兰;DG645数字脉冲延迟发生器 Stanford Research Systems,USA;冷却循环系统、SC300二维旋转平台 北京卓立汉光北京;启天B4550-B193 计算机 联想(北京)有限公司,中国。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 饲料样品制备 实验所用饲料均是按照猪饲料配方[21]配制而成,配方原料用粉末粉碎机粉碎并按一定比例均匀混合;在饲料中添加分析纯无水硫酸铜并在振荡器上匀速振荡5 min均匀混合,制备含铜量509 μg/g样品用来进行实验参数优化,用手动压片机压制成直径30 mm的圆饼状样品,共56个样品。定标实验用精密电子天平称取一定量的无水硫酸铜与50 mL超纯水配制18组不同浓度的硫酸铜溶液,将自制饲料与溶液置于120 mm培养皿中搅拌均匀,静置30 min后将18组培养皿放入冷冻干燥机干燥。最后用精密电子天平称取每组3份4 g干燥饲料用手动压片机压制成直径30 mm的圆饼状样品,共54个样品。样品数据分为两部分,一部分作为建模数据集(样本数n=42),另一部分作为预测数据集(样本数n=12),利用PLS建模方法对两部分数据分别进行建模与预测分析。

1.2.1.2 饲料样品浓度检测 为了获取18组浓度定标样品中Cu元素的真实浓度,用湿法消解对每组饲料样品进行消解处理,然后再用原子吸收分光光度计(AAS)仪器上测量得到每组浓度样品中Cu元素的真实浓度。本实验采用湿法消解及AAS法测量的具体过程如下:对每组样品用精密电子天平称取0.3 g猪饲料样品,均放入150 mL的三角烧瓶中,加入30 mL混合酸(优级纯HNO3和HClO4比例为5∶1)后静置过夜,然后置于温度为380 ℃的电热板上加热,一直加热到溶液颜色变浅、冒白烟,直到瓶中物质呈无色透明为止。待冷却后用少量稀硝酸冲洗烧瓶,再用超纯水定容至50 mL容量瓶中,同时做空白试剂。利用原子吸收分光光度计对定容好的溶液进行Cu浓度的测量,每一个样品浓度均是三次重复测量的平均结果。

1.2.2 激光诱导击穿光谱采集 实验所用LIBS系统实验装置如图1所示。激光束穿过45°反射镜,再垂直穿过焦距为100 mm的聚焦透镜聚焦于样品表面产生等离子体,发光等离子体穿过聚焦透镜成为平行光,再经穿孔反射镜水平入射到透镜,聚焦到光纤探针上。光谱仪通过光纤收集光谱信号最终显示在计算机上,为了避免激光打在同一点上,样品放置于水平精密旋转平台上。LIBS光谱采集时,激光每击打5次平均1幅图,1次采集20幅图,即每个位置上样品旋转采集100个点平均1幅图,且每个样品选取3个位置测量。

图1 LIBS系统实验装置Fig.1 LIBS system test device

1.2.3 实验参数条件的优化

1.2.3.1 A、B两激光之间的延迟时间单因素实验 应用双束激光主要是为了延长等离子体的发光寿命,以提高LIBS的检测精度。激光延迟时间为A激光与B激光两束激光之间发射的时间差。首先对激光延迟时间进行优化,激光能量设为A激光157.77 mJ、B激光158.57 mJ,采集延时为1.28 μs,激光延迟时间设为0、100、200、250、300、350、400、450 ns。

1.2.3.2 正交实验 采用正交实验法对双脉冲饲料中铜元素的检测进行参数优化。选取A束激光能量(A)、B束激光能量(B)、两束激光延迟时间(C)、激光采集延时(D)为考察因素,根据每个因素实验装置要求参数设置范围,每个因素选取4个水平,涵盖整个参数范围,用正交表L16(44)安排实验,因素水平表见表1,实验设计见表2。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.3 数据处理

运用软件对实验所获得的数据进行处理。通过不同点数平滑处理方法和各种预处理方法对数据进行处理,得出效果最好的处理方法,最终进行对建模集样品进行PLS建模并且对预测集样品进行Cu元素的浓度预测。

模型中评价指标r(相关系数)是研究样品真实浓度和预测浓度之间线性相关程度的量;RMSEP(预测集均方根误差)用来衡量预测浓度与样品真实浓度之间的偏差;ARE(平均相对误差)表示预测浓度偏离真实浓度的大小,RMSEP和ARE均可以用来衡量模型预测精度。r值越大,RMSEP和ARE值越小说明模型的质量越高。

2 结果与讨论

2.1 饲料样品真实浓度

54个饲料样品的真实浓度结果如表2所示,每一个样品浓度均是三次重复测量的平均结果。

表2 猪饲料样品Cu元素真实浓度(μg/g)Table 2 True concentration of Cu element in pig feed samples(μg/g)

2.2 实验参数条件的优化

2.2.1 猪饲料中Cu元素LIBS特征光谱的确定 图2为含铜量为509 μg/g的猪饲料样品在312～335 nm的LIBS光谱图。根据NIST原子光谱数据库,可知324.74、327.38 nm波长均为Cu元素的特征谱线。由于Cu I 324.74 nm的谱线强度较大,更有利于分析检测,因此选择该谱线作为分析特征谱。

图2 猪饲料样品在312～335 nm波段内的LIBS光谱图Fig.2 LIBS spectrum of pig feed samples in 312～335 nm band

2.2.2 实验参数条件的优化

2.2.2.1 A、B两激光之间的延迟时间实验 图3所示为含铜量为509 μg/g饲料样品在各延迟时间下的谱线强度,延时为400 ns时谱线基线上漂移量最小,延时为200 ns时,Cu元素的光谱强度最大,但是此时谱线上漂移量也是最大。因此为了便于分析,选择基线漂移量较小的300、350、400、450 ns,作为正交实验的水平参数。

图3 含铜量为509 μg/g饲料样品在各延迟时间下的谱线强度Fig.3 Spectral intensity of the feed samples with copper content of 509 μg/g at each delay time

2.2.2.2 正交实验 以饲料样品中铜元素的LIBS光谱强度为评价指标,实验设计及结果见表3。

表3 L16(44)正交实验设计及结果Table 3 Design and results of L16(44)orthogonal test

上述分析结果中,根据表4中R值可得,因素的主次顺序可排列为:D>B>C>A,即采集延时>激光B能量>激光延迟时间>激光A能量,由K值可得最优组合为A4B4C4D1,即采集延时1.28 μs,激光延迟时间为450 ns,激光A能量为157.77 mJ,激光B能量为196.87 mJ。

2.3 PLS结果与讨论

2.3.1 不同点数平滑处理对PLS模型的影响 影响LIBS光谱质量的因素有很多,如实验仪器参数、样品表面特性、基体效应等因素,从而导致光谱噪声大,光谱噪声对于特征信号的影响特别大。这些因素会导致LIBS检测的不稳定性,对检测造成干扰信息,因此对于干扰信息的处理对样品的定量分析非常重要。

采用偏最小二乘法对猪饲料样品的LIBS数据进行分析,并比较在PLS基础上结合不同点数的平滑处理和不同预处理方法建立的模型的准确性,不同点数的平滑处理对PLS模型质量影响如表4所示。

由表4中可以看出在9点数平滑时,模型的质量都比较好,9点数平滑模型r值、RMSEP、ARE分别达到0.9879、15.10、8.24%,较其他点数平滑模型质量具有一定优势。

表4 不同点数的平滑处理对PLS模型质量影响Table 4 Influence of different points smoothing on PLS model quality

2.3.2 各种预处理方法对PLS模型的影响分析 经平滑处理消除噪声影响后,为减少LIBS数据的基线偏移、漂移和背景等干扰,已有较多相关文献[22-23]对样本光谱运用多元散射校正(MSC)、标准正态変量変换(SNV)、均值中心化(MC)、一阶导数(FD)和二阶导数(SD)等预处理方法。表5是9点平滑处理结合各种预处理方法对PLS模型模型参数,可知当采用均值中心化预处理方法时,9点平滑PLS模型的样品真实浓度和预测浓度之间线性相关程度较好,样品预测浓度和真实浓度之间的偏差和预测浓度偏离真实浓度均较小,模型参数r、RMSEP、ARE分别达到了0.9855、14.57、9.24%,与9点平滑处理相比较,9点平滑模型参数r和ARE均比9点平滑结合均值中心化预处理模型参数有一定优势。可以得出结论,9点平滑预处理相结合,可以有效地降低噪声信息,提高PLS模型分析LIBS光谱数据的准确性。

表5 9点平滑结合各种预处理方法对PLS模型的影响Table 5 9 point smoothing combined with various pretreatment methods on the PLS model

2.3.3 PLS建模及模型验证 为了实现对饲料中Cu元素进行定量检测,采用9点平滑处理PLS建立模型并对实验结果进行定量分析。利用建模集42个饲料样品预测浓度与真实浓度的PLS校正模型和12个预测集饲料样品预测浓度与真实浓度的预测模型分别如图4(a)、4(b)。由图4(a)可知,该模型的预测结果较好,建模集样品中Cu元素含量的预测值与真实值之间的相关系数分别为0.9879;预测集样品中Cu元素含量的预测值与真实值之间的相关系数为0.9963,如图4(b)所示。表6列出了预测集12个饲料样品Cu元素的真实浓度、模型预测浓度和预测相对误差。12个预测集样品的Cu含量预测平均相对误差为8.24%,表6预测结果显示预测偏差总体呈现浓度越大,预测偏差越小的趋势,分析其原因是低浓度样品中所含Cu元素的浓度较小,在每个样品中的分布均匀性较差使得实验结果存在较大误差。综上可知,模型的预测浓度和真实浓度有较好的吻合性,建立的模型质量较好,具有较好的预测性。

表6 预测集PLS模型中样品Cu的预测浓度与真实浓度对照Table 6 Prediction concentration and real concentration of sample Cu in prediction set PLS model

图4 PLS模型预测结果Fig.4 PLS model prediction results注:a:建模集;b:预测集。

3 结论

LIBS是农产品中铜检测的一种先进方法,作为一种新兴的检测分析技术有别于传统重金属检测分析技术。本文结合正交实验设计对饲料样品中Cu元素进行了LIBS实验参数优化,采用直观分析法得出最佳实验参数条件,对饲料中的Cu元素浓度结合偏最小二乘法进行定量分析,并且采用湿法消解与原子吸收分光光度计测得定量分析的样品Cu元素的真实浓度。基于PLS,分别比较了不同点数平滑处理和各种预处理方法对PLS模型质量影响,最后得出,结合9点平滑预处理能有效降低噪声信号,提高PLS模型分析LIBS光谱数据的准确性。实验结果表明,将LIBS光谱数据用PLS方法建模进行定量分析的结果与标准值的相对误差较小,能够提高分析结果的准确性。

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DetectionofCuelementinpigfeedbydoublepulselaserinducedbreakdownspectroscopy

LIUShan-shan1,2，ZHANGJun3,LINSi-han1,2,LIUMu-hua1,2,4,LAIQu-fang1,WANRen-jie1,LIJing1,2,4,*,MEIYu1

(1.College of Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment,Nanchang 330045,China;3.College of Animal Science and Technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;4.Collaborative Innovation Center of Postharvest Key Technology and Quality Safety ofFruits and Vegetables in Jiangxi Province,Nanchang 330045,China)

Double pulse laser-induced breakdown spectroscopy(LIBS)technique for the determination of Cu in pig feed was studied in this paper. Combined with orthogonal design,parameters optimization of Cu in pig feed samples,LIBS test was carried out. According to the sum of the indexes in the visual analysis of the orthogonal experiment,the best experimental parameters were obtained. The laser energy of A was 157.77 mJ and B was 196.87 mJ. And the delay time of laser was 450 ns and gathering was 1.28 μs. Based on partial least squares(PLS),the influence of different points smoothing and various pretreatment methods to the PLS model prediction effect were compared. Finally,the combination of 9 point smoothing pretreatment could effectively reduce the noise signal. It could improve the accuracy of PLS model for analyzing LIBS spectral data. Model predictions were as follows:correlation coefficient(r),root mean square error of prediction(RMSEP)and average relative error(ARE)were 0.9879,15.10,8.24%,respectively.

laser induced breakdown spectroscopy;pig feed;copper element;PLS

2017-04-18

刘珊珊(1992-)，女，硕士研究生，主要从事农产品光谱检查技术方面的研究，E-mail：592591823@qq.com。

*通讯作者:黎静(1978-)，女，博士，副教授，主要从事农产品光谱检查技术方面的研究，E-mail：lijing3815@163.com。

国家自然科学基金项目(31460419)；猪饲料中高铜的激光诱导击穿光谱快速检测技术研究(GJJ160369)和赣鄱英才555工程。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0198-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.037