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(重庆科技学院化学化工学院,重庆 401331)

大孔吸附树脂法分离纯化红景天中洛塞维

杨清林,葛静秋

(重庆科技学院化学化工学院,重庆 401331)

本文采用大孔吸附树脂法对红景天中洛塞维(Rosavin)分离纯化进行了研究,建立了如下工艺条件:Rosavin检测的高效液相(High performance liquid chromatography,HPLC)最佳的流动相为乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v),最佳柱温为30 ℃;选用非极性树脂D312,最大吸附量上样浓度为0.24 mg/mL,装柱高度为30 cm,粗品最大上样量为4 BV,上样流速为1～2 BV/h,洗脱剂为50%乙醇溶液。大孔吸附树脂分离纯化目的物Rosavin的含量由3.00%提高到了68.76%。大孔吸附树脂法分离纯化洛塞维的工艺条件合理,节约成本、收率高,适合工业应用。

红景天,洛塞维,高效液相,大孔吸附树脂,分离纯化

红景天也叫黄金根、玫瑰根、北极玫瑰,拉丁名Rhodiolasaera,为景天科多年生草本植物[1]。现代医药研究表明[2],玫瑰红景天具有多种生物活性,包括抗菌、抗癌[3-4]、抗抑郁、抗焦虑[5-6]、抗炎、抗糖尿病[7-8]、抗疲劳[9]、抗氧化以及促进肝的再生的功能,此外,还具有增强学习和记忆能力。洛塞维(Rosavin)是红景天中的独特活性成分,并且只存在于红景天科玫瑰红景天(拉丁名RhodiolaRosea)中[10],具有增强免疫功能、保护心血管等多种功能[11]。

目前国内对于红景天中洛塞维的分离纯化研究较少,Dubichev AG等[12]首先建立对Rosavin的HPLC检测,并证明了Rosavin在放置过程中容易被酵解。王曙等[13]建立的HPLC法分析了红景天属植物根茎中Rosavin的含量并进行了相应的含量测定,同时验证了Rosin和Rosarin的存在,崔晋龙等[14]HPLC法测定大花红景天中Rosavin的含量。目前对Rosavin的分离纯化主要采用溶剂萃取结合硅胶柱层析和大孔吸附树脂分离这两种方法。马朝阳等[15]通过对HPD系列、AB-8、D101、LSA-10等几种大孔吸附树脂的筛选发现,非极性树脂更有利于Rosavin的分离纯化。黄海松等[16]使用色谱树脂来制备高纯度的红景天苷,Han等[17]使用高速逆流层析直接得到了高纯度的红景天苷和Rosavin。但这两种方法对于原料和设备的质量要求高,过程繁琐,原料的消耗和产物的损耗很大,在工业应用中受到限制。

大孔吸附树脂作为一种新型的分离纯化树脂而具有节约成本、过程优化以及高收率等特点,本文旨在通过对Rosavin HPLC条件的建立、大孔吸附树脂的筛选以及其层析过程条件优化的研究,建立一条适用于应用大孔吸附树脂分离和纯化Rosavin的工艺路线,为工业上分离纯化Rosavin的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Rosavin对照品(纯度≥95%) 购自上海时代生物科技有限公司;Rosavin粗品(主要含Rosavin≥3%、Rosarin和Rosin>1%) 购自西安普莱特生物工程有限公司;乙腈(HPLC纯,500 mL/瓶)、磷酸(HPLC纯,500 mL/瓶) 均购自科密欧化学试剂有限公司;甲醇(HPLC纯,500 mL/瓶) 购自重庆川东化工集团化学试剂厂;乙醇(工业级) 购自重庆纳漫生物科技有限公司。

HPLC色谱分析仪(P230II型色谱系统) 大连依利特分析仪器有限公司;D101、LX-11、LSA-21树脂 西安蓝晓科技新材料股份有限公司;HPD-100、HPD-300树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司;D312树脂 山东鲁抗生物制造有限公司;SHZ-A水浴恒温振荡器 海博讯实业有限公司医疗设备厂;层析柱0×50 cm 北京瑞达恒辉科技发展有限公司;BT100-1J蠕动泵 保定兰格恒流泵有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂的配制 对照品和供试品的配制:精密称定10 mg Rosavin对照品,在10 mL容量瓶中用超纯水定容,摇匀,放入4 ℃冰箱中保存备用,其浓度为1 mg/mL。称取Rosavin粗品1 g,超纯水溶解成1 mg/mL的溶液,摇匀后放入4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 流动相的配制 配制六种不同种类的流动相:分别将色谱纯度的磷酸溶液配制成体积百分比为0.05%、0.06%、0.15%和0.2%的磷酸溶液,与色谱纯度的甲醇按照88∶12、95∶5、90∶10、80∶20、14∶86和43∶65的体积比例进行混合[18],过0.25 μm的微孔有机滤膜后超声除气15 min。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Hyper ODS2 C185 μm 4.6×200 mm,流速:1 mL/min,进样量:10 μL,检测波长:254 nm,洗脱梯度:等度洗脱。

1.2.4 流动相的筛选 分别用六种不同的流动相对Rosavin标准溶液进行检测,对照这六种流动相下的峰面积、峰型以及出峰时间等,初步筛选出优化的流动相条件。将柱温控制在30 ℃的平均水平,对于30 ℃上下的两种温度27 ℃和35 ℃进行比较。在这些流动相条件下对Rosavin粗品进行检测。分别对比Rosavin对照品和粗品的色谱图结果,筛选出最佳流动相条件。

1.3 树脂的筛选

称取Rosavin粗品33.0 g,用330 mL纯净水溶解配制成0.1 g/mL溶液后进行10 min离心(5000 r/min),放入4 ℃冰箱中备用。根据Rosavin的性质选取六种比较常见的非极性或者弱极性的大孔吸附树脂。称取活化后的树脂5 g(干重)左右,放入50 mL有塞锥形瓶中,分别向其中加入50 mL左右的Rosavin粗品溶液,放置于水浴摇床进行摇床静态吸附,吸附2 h达到平衡后,过滤出得到吸附液。HPLC法测定每瓶吸附液吸附后Rosavin的浓度,计算每种树脂不同初始浓度下的吸附量,比较各种树脂对相同浓度的Rosavin吸附量大小,对这几种树脂进行筛选。然后通过吸附模型-静态吸附等温曲线,得到最大吸附量值,筛选出最优化树脂D312。

1.4 层析方法的确定

1.4.1 树脂装柱高度的选择 选择相同型号的4根玻璃层析柱,用纯净水淘洗D312树脂,装柱高度分别为10 cm(20 mL)、20 cm(40 mL)、30 cm(60 mL)、35 cm(70 mL),将树脂清洗干净,用2倍柱体积(BV)的乙醇冲洗,将样品配制成浓度为0.24 mg/mL的溶液,上样量均为4 BV,以流速为1 mL/min进行上样,上样后用HPLC检测穿透液中Rosavin的浓度,计算出每种装柱高度的吸附量。

1.4.2 上样流速和上样量的选择 选择三根相同规格的层析柱,用1.4.1的方法进行装柱,装柱高度为筛选出的柱高。将Rosavin粗品配制成浓度为0.24 mg/mL的样品溶液准备,分别以上样流速为1、2 BV/h和4 BV/h进行上样。上样过程中在0.5 BV的节点时检测穿透液中Rosavin的浓度,并绘制流速-Rosavin浓度曲线。

1.4.3 洗脱梯度的选择 按照1.4.1的装柱方法,用D312树脂进行装柱,装柱高度、上样量和上样流速由以上实验结果得出,用0.24 mg/mL的Rosavin粗品上样,上样结束后,依次用30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇进行洗脱,洗脱流速为1 BV/h,洗脱体积均为最大上样量。依次收集洗脱液,用HPLC检测Rosavin的含量。

2 结果与讨论

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1 流动相的确定

2.1.1.1 流动相的初步筛选 六种流动相下对Rosavin对照品进行检测图谱分别如下:

图1 不同流动相下对照品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Rosavin control article under different mobile phases

如图1a～c所示,甲醇-0.06%磷酸体系下色谱峰面积很小,主峰之前有很明显的溶剂峰和杂峰,出峰的时间在5～8 min,出峰的时间较早;如图1d～f所示,乙腈-磷酸体系下色谱溶剂峰小并且很稳定,出峰时间在20～30 min之间,更容易进行控制,但是乙腈-0.15%磷酸(14/86,v/v)流动相条件下的峰太小,理论塔板数不高。通过以上六个色谱图的比较,初步选定乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)这两种流动作为优选流动相。

这六种色谱图组分中的主峰面积和面积百分比如表1所示。

表1 六种流动相的主峰面积及面积百分比Table 1 Six flow peak area and area percentage

从表中可以看到六种图谱的主峰面积以及其相应的面积百分比,实验表明,乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)这两种流动相下的主峰面积更大,面积百分比分别约为98%和99%,基本上符合Rosavin对照品的含量。

2.1.1.2 最佳流动相的选择 在乙腈-0.05%磷酸(12/88,v/v)和乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)这两个流动相下Rosavin对照品和Rosavin供试品检测图谱结果如下:

图2 Rosavin对照品和供试品 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Rosavin control article and sample

如图2a所示,Rosavin对照品在31 min左右出峰,但是供试品的峰型却很杂乱,峰面积小;如图2b所示,在流动相为乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)时,对照品和供试品都表现出了比较好的检测结果,rosavin出峰的时间为21 min左右,供试品中主要有三种不同的成分,与结果相符合。因此乙腈-0.2%磷酸(65/43,v/v)是最优化流动相条件。

表2 浓度与平均峰面积关系Table 2 Relationship between concentration and peak area

2.1.2 柱温的选择 柱温为27、30、35 ℃时,Rosavin对照品的检测结果如下:

图3 Rosavin对照品不同柱温的HPLC色谱图Fig.3 HPLC Chromatogram of Rosavin control article in different column temperature

如图3a所示,柱温为27 ℃时Rosavin有明显的出峰情况,但溶剂峰杂乱;如图3c所示,柱温为35 ℃时Rosavin出峰不明显。这两个柱温条件下的出峰面积都比在30 ℃条件下小,出峰的时间很短,主峰面积百分比也不高,如图3b所示。因此,判定30 ℃为检测Rosavin的最佳柱温条件。

2.1.3 线性回归方程 用5种不同浓度的Rosavin用以上HPLC条件检测其平均峰面积,建立线性回归曲线图4所示:

以浓度和平均峰面积做回归曲线,得到以下线性方程:

y=17.129x-51.619,R2=0.9996,符合线性回归的要求,证明建立的HPLC条件可以用来检测Rosavin。

图4 线性回归曲线Fig.4 Linear regression curve

2.2 大孔吸附树脂的筛选

2.2.1 树脂的初选 HPLC检测法检测出每种树脂吸附后Rosavin吸附液中Rosavin的峰面积S,计算出其吸附后浓度Ce和吸附量qe,做出qe的对比图,结果如下所示:

表3 六种树脂吸附后参数Table 3 Six kinds of resin adsorption parameters

如图5所示,六种树脂吸附量的大小是LX-11>D312>LSA-21>HPD 300>D101>HPD 100,LX-11和D312这两种树脂的吸附量比其他四种树脂要大,这两种树脂均为非极性树脂,说明树脂的极性越小,更有利于目的物的吸附。静态吸附过程初步选定LX-11和D312这两种树脂进行进一步的选择实验。

图5 六种树脂的吸附量对比图Fig.5 Comparison of adsorption capacity of six resins

2.2.2 最优树脂的选择 两种树脂的吸附量结果计算分别如表4、表5所示。

表4 不同浓度原液下D312树脂吸附量结果Table 4 The adsorption of D312 resin under different concentrations

表5 不同原液浓度下LX-11树脂吸附量结果Table 5 The adsorption of LX-11 resin under different concentrations

表6 柱体积与穿透液中Rosavin的浓度关系Table 6 The relationship between the column volume and the concentration of Rosavin in the penetrating fluid

根据表4和表5计算结果,分别以D312树脂和LX-11树脂吸附量qe为纵坐标,吸附后浓度Ce为横坐标,绘制静态吸附等温曲线:

如图6所示,D312树脂和LX-11树脂的等温曲线符合II型等温曲线--S型曲线模型。随着原液浓度的增加,树脂吸附量也会相应增加,但是吸附量会逐渐趋于一个平衡值,也就是达到一个最大的吸附量值。到达最大吸附量后,吸附量大小将与原液浓度无关。静态吸附等温曲线表明,D312的最大吸附量值大于LX-11,因此判定 D312树脂为最优化的吸附树脂,其对应的吸附原液浓度为0.24 mg/mL。

图6 25 ℃下静态吸附等温曲线Fig.6 Static adsorption isotherm at 25 ℃

2.3 层析条件的建立

2.3.1 柱体积的影响 检测结果和柱高-吸附量曲线如图7所示。

图7 柱体积与吸附量关系曲线Fig.7 The curve between column volume and adsorption concentration

如图7所示,随着柱体积的增加,树脂的吸附量也会相应的增加,但是当柱体积达到60 mL以后,吸附量将会趋于平衡,也就是到达了最大的吸附量值,在最大吸附量下的柱体积就是最佳的装柱体积,柱高30 cm,柱体积约为60 mL。

2.3.2 上样流速以及上样量的影响 上样检测结果与流速-Rosavin浓度关系曲线如下所示:

表7 流速与Rosavin吸附量关系Table 7 Relationship between flow velocity and Rosavin adsorption

如图8所示,随着上样量的增加,穿透液中Rosavin的浓度也会相应的增加,即吸附量相应的减少。在上样量为3 BV之前,目的物基本上被全部吸附;上样量大于3 BV之后,4 BV/h上样流速下穿透液中Rosavin的浓度急速增加,大大的超过了树脂的最大吸附量,因此4BV/h的流速不能用作上样流速;上样量在3 BV～4.5 BV时,1 BV/h和2 BV/h的流速下穿透液中Rosavin的浓度呈现一种稳定值,在树脂的吸附量范围之类;当超过了4.5 BV上样量之后,穿透液中Rosavin的浓度也开始快速增加,超过树脂的吸附量范围。

图8 上样流速与Rosavin浓度关系曲线Fig.8 The curve between sample flow rate and Rosavin

由图8曲线可知,D312树脂装柱高度为30 cm时,Rosavin粗品的上样量是4 BV,上样的流速是1～2 BV/h。

2.3.3 洗脱梯度的影响 乙醇梯度洗脱下的Rosavin检测图谱如下:

HPLC检测图谱中Rosavin的出峰时间约为21 min左右,如图9a所示,30%乙醇进行洗脱时只有少量的杂质被洗脱出来,目的物Rosavin基本上不能解吸附;如图9b所示,随着洗脱剂中乙醇浓度的增加,用40%乙醇进行洗脱时,色谱图呈现出杂质和目的物交叉出样的现象,有大量的杂质被洗脱下来,但是目的物Rosavin以及与其结构相似的Rosin和rosarin也会被少量的洗脱下来;如图9c所示,在50%乙醇洗脱梯度下,目的物Rosavin会被大量的洗脱下来,但是相应的Rosin洗脱出来的含量也会增加,另外也会有其他少量杂质被洗脱出来。实验结果表明,在洗脱梯度的选择中,对于应用D312大孔吸附树脂初步分离纯化Rosavin,30%乙醇可作为层析柱过程的流动相,50%乙醇可作为目的物洗脱剂。

图9 Rosavin不同乙醇浓度洗脱过程HPLC图谱Fig.9 HPLC spectra of Rosavin elution process in different ethanol concentration

2.4 洛塞维的分离纯化

分三次取Rosavin粗品(Rosavin含量为3%),按上述讨论结果,在柱高为30 cm、上样浓度为0.24 mg/mL、最大上样量为4 BV、上样量为1～2 BV/h的条件下,用50%乙醇作为洗脱剂洗脱出来的溶液进行HPLC含量测定,检测得到Rosavin的含量平均为68.76%。

表8 分离纯后Rosavin的含量Table 8 The rosavin content of separation and purification

3 结论

采用大孔吸附树脂法对红景天中洛塞维分离纯化进行研究,建立一条适用于应用大孔吸附树脂分离和纯化Rosavin的工艺路线,该工艺为柱高30 cm、上样浓度0.24 mg/mL、最大上样量4 BV、上样量1～2 BV/h,洗脱剂50%乙醇,此条件下分离纯化所得到的目的物Rosavin含量由3.00%提高到了68.76%,回收率达85.44%,得到了Rosavin纯度和回收率比较高,从树脂吸附角度看,本实验采用的大孔树脂纯化方法明显优于其他文献报道的方法。

就工艺而言,虽然应用溶剂萃取结合硅胶层析可以得到更高纯度的Rosavin,但是过程繁琐,原料的消耗和产物的损耗很大,大孔吸附树脂作为一种新型的分离纯化树脂,通过物理吸附溶液中有机物,并不会改变物质的化学结构,而具有节约成本、过程优化以及高收率等特点,为在工业应用中分离纯化Rosavin提供了可能。

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TheisolationandpurificationofRosavinbythemacroporousadsorptionresin

YANGQing-lin,GEJing-qiu

(Chemistry and Chemical of Engineering College,Chongqing University of Science & Technology,Chongqing 401331,China)

To establish a method for the Rosavin of isolation and purification,the result of process conditions were as follows:the conditions of HPLC test is acetonitrile-0.2% phosphoric acid(65/43,v/v)of mobile phase,and column temperature condition 30 ℃;on the comparison of six resin’s adsorption and the establishment of the resin were preliminary isothermal static adsorption curve,we can determined the optimal resin was D312 resin,and the largest loading concentration was 0.24 mg/mL;column height 30 cm,sample size 4 BV,flow rate 1～2 BV/h. The results showed that the Rosavin content had increased from 3.00% to 68.76%,based on the consideration of four factors in column chromatography process. The macroporous adsorption resin of isolation and purification of Rosavin is reasonable,it is suitable for industrial applications.

rhodiola rose;Rosavin;HPLC;the macroporous adsorption resin;isolation and purification

2017-03-22

杨清林(1974-)，男，硕士，研究方向：生化检测和仪器分析，E-mail:qlyangcqu@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0079-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.017