, ,2,*,,梅萍,

(1.钦州学院食品工程学院,广西钦州 535011;2.广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室,广西钦州 535011)

周采燕1,黄海1,2,*,李娜梅1,黄梅萍1,莫小云1

(1.钦州学院食品工程学院,广西钦州 535011;2.广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室,广西钦州 535011)

探讨牡蛎肽-锌纳米粒的形成条件及稳定作用力。通过透光率检测初步筛选牡蛎肽-锌纳米粒形成的条件,用粒径分析和电镜观察方法确认纳米粒的形成。通过次级键破坏实验分析稳定纳米颗粒空间结构的作用力。结果表明,在牡蛎肽中加入0.5%～0.9%的硫酸锌后,将体系pH调至6.0～11.0,即可制得粒径为28～102 nm的牡蛎肽-锌纳米粒。锌是纳米粒的必需组分,疏水作用和静电相互作用是稳定纳米粒的关键作用力。牡蛎肽-锌纳米粒有望成为新型补锌制剂。

牡蛎肽,纳米粒,形成,稳定作用力

纳米型矿物元素补充剂具有显著的促矿物元素吸收效果[1-2],因此开发纳米型矿物元素补充剂越来越得到研究者们的关注。利用蛋白肽、多糖等生物分子调控矿物元素纳米化的生物模板法具有反应条件温和的优势[3-4],例如Zhang[5]和黄海等[6]分别利用大豆分离蛋白和鱼卵磷酸肽制备肽-钙纳米粒,Wu[7]等利用鳀鱼肽制备肽-铁氧化物纳米粒,高义霞[8]和杨梦涛[9]等分别利用刺槐豆多糖和牡蛎多糖制备多糖-硒纳米粒。锌是人体必需的矿质元素之一,在人体生长发育、生殖遗传等重要生理过程中起到至关重要的作用。然而由于锌的吸收利用率较低,锌缺乏症常见[10-11]。牡蛎是著名的补锌食材,因此利用牡蛎开发补锌制品得到研究者们的关注。目前关于此方面的研究较少,而且全都集中在利用牡蛎肽或蛋白酶解物与硫酸锌结合形成复合物上[12-14]。然而蛋白肽与锌是否能形成纳米粒及其形成条件的研究还未见报道。本论文将对牡蛎肽-锌纳米粒的形成条件及其稳定作用力进行系统研究,为纳米型肽-锌复合物类补锌制剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

去壳鲜钦州大蚝(近江牡蛎) 平均18 g/个,购自钦州仟仟万家超市;尿素、十二烷基苯磺酸钠(SDS) 上海生工;胰蛋白酶 酶活190 kU/g,南宁庞博生物工程有限公司;实验所用其它试剂 均为分析纯及以上。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海雷磁仪器厂;UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司;ZEN3600粒径分析仪 英国Malvern 公司;JEM-1200EX透射电镜 日本JEOL公司。

表1 牡蛎肽与硫酸锌混合溶液的透光率(%)Table 1 The Transmittance of oyster peptide-zinc solvents(%)

注:同一列上标不同字母表示差异显著(p<0.05),表3、表4同;-表示浑浊或沉淀。

表2 牡蛎肽与硫酸锌混合形成纳米粒的条件Table 2 The formation conditions of oyster peptide-zinc nanoparticles

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎肽的制备 牡蛎清洗去除杂质后,沥干,组织捣碎,用2倍体积的正己烷-无水乙醇(1∶3)在50 ℃浸泡搅拌脱脂8 h,六层纱布过滤,得到滤渣再重复脱脂2次,收集滤渣、晾干、研磨后过150目筛,即得脱脂牡蛎粉。脱脂牡蛎粉按照作者前期酶解优化实验得到的条件进行酶解,具体条件为:经胰蛋白酶在49 ℃、加酶量3000 U/g、底物浓度2%、pH9.0条件下酶解2 h,用0.1 mol/L NaOH和HCl维持pH稳定。酶解完成后在100 ℃灭酶10 min,冷却,于10000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,将上清液过0.45 μm微孔滤膜即得牡蛎肽,-18 ℃冷冻备用。

1.2.2 纳米粒形成初判 预先配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%系列浓度硫酸锌溶液,与7 g/L的牡蛎肽溶液等体积混合,每种混合溶液均调节pH至3.5、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0,在600 nm处测定其透光率。同时测定对应pH下的牡蛎肽溶液和同浓度硫酸锌溶液的透光率,以二者中透光率低者为基准透光率。当样液不产生浑浊或沉淀且透光率比基准透光率下降20%时,即初判纳米粒形成[5]。

1.2.3 粒径分析 测定参数设置为:光源He-Ne激光灯,波长633 nm,入射角173°,粘度1.0031,RI 1.330,25±0.1 ℃,平衡时间60 s,每个样品扫描3次,取平均值,并得到粒径分布系数(particle dispersion index,PDI),PDI越小说明粒径分布越均匀。

1.2.4 电镜分析 将待测样液吸附在铜网上,自然风干5～10 min后用磷钨酸负染,自然风干后置于80 kV透射电镜上观察。

1.2.5 稳定纳米颗粒作用力分析 在通过四种条件(0.5%硫酸锌,pH6.0;0.6%硫酸锌,pH6.5;0.8%硫酸锌,pH7.0;0.9%硫酸锌,pH8.0)制备的纳米粒溶液中,加入2.5 mol/L EDTA溶液,摇匀后静置1 h,测定透光率并进行电镜观察,研究去除锌离子对纳米粒的影响。同理往上述四种纳米粒溶液中加入0.01% SDS,考察疏水作用对纳米粒的影响；加入2 mol/L尿素,考察氢键对纳米粒的影响；调节四种纳米粒溶液的pH至2～11,研究静电相互作用对纳米粒的影响[5]。

1.3 数据统计分析

所有实验均做三个平行,运用SPSS统计软件进行方差分析和LSD检验。数据以均数±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 牡蛎肽-锌纳米粒形成初判

从表1可以看出,混合体系的透光率随着pH的上升而增加,却随着硫酸锌浓度的上升而下降。根据纳米粒形成的判定条件,将能够形成纳米粒的条件归纳在表2中。由表2可知,牡蛎肽不能与低浓度的硫酸锌(0.4%及以下)形成纳米粒。当硫酸锌浓度达到0.5%以上时,牡蛎肽才能与硫酸锌形成纳米粒,而且要求pH最低为6.0,且随着硫酸锌浓度的上升,纳米粒形成所需的最低pH增大,且pH范围也增大。当硫酸锌浓度达到0.9%时,纳米粒形成的pH最高可达11,pH范围增大到3个单位。

实验中发现牡蛎肽在pH大于5时均呈澄清状,透光率维持在81%左右,而pH降至3.5时发生浑浊,表明牡蛎肽的等电点pI为3.5左右,牡蛎肽中含有带负电的酸性基团,这些基团是与锌离子结合的化学基础。而所有硫酸锌溶液均在pH大于6.5时产生沉淀,在pH6.0以下保持澄清,透光率稳定在90%左右(数据未列出)。虽然牡蛎肽不能与低浓度的硫酸锌(0.4%及以下)形成纳米粒,却能够抑制硫酸锌在pH6.5～11范围内产生沉淀,这可能是由于牡蛎肽中的酸性基团与锌离子结合从而抑制其形成氢氧化锌沉淀。Huang等[15]在研究鲤鱼卵肽时发现,鲤鱼卵肽含有大量带负电的磷酸丝氨酸基团,能够抑制钙在pH7.8的磷酸盐体系下沉淀,这与本结果相一致。

由表1还可看出,牡蛎肽发生聚集沉淀的pH随着硫酸锌浓度的升高而升高,从硫酸锌浓度为0.3%以下时的pH3.5发生沉淀到硫酸锌浓度为0.9%时的pH7.0发生沉淀。这与纳米粒形成的pH变化趋势是一致的,说明纳米粒的形成与牡蛎肽分子的聚集是相关的。黄海等[16]揭示鱼卵磷酸肽-钙纳米粒的形成是由于钙离子与磷酸肽分子的负电基团结合产生电荷屏蔽效应,并且钙离子在磷酸肽分子中充当盐桥,导致鱼卵磷酸肽聚集形成纳米粒。由于牡蛎肽也含有负电基团且锌离子也是多价金属离子,因此牡蛎肽-锌纳米粒的形成也可能是这种“盐桥效应”机制。

2.2 牡蛎肽与锌离子形成纳米粒的确认

表3 牡蛎肽-锌纳米粒的粒径分布Table 3 The size distribution of oyster peptide-zinc nanoparticles

2.2.1 牡蛎肽-锌纳米粒的粒径分布 由表3可知,在表2中列出的纳米粒形成条件下均能形成粒径为28～102 nm的纳米颗粒,且分散性良好(PDI<0.4)。通过分析可知,随着pH的下降和硫酸锌浓度的上升,颗粒粒径增大。当硫酸锌浓度为0.9%时,纳米粒的粒径由pH11.0的28 nm上升到pH8.0的101 nm;当pH为8.0时,纳米粒的粒径由0.8%硫酸锌浓度的59 nm上升到0.9%硫酸锌浓度的101 nm。如前所述,体系pH的变化会引起牡蛎肽的带电情况,pH下降就接近牡蛎肽的等电点(pI 3.5),牡蛎肽带电变少,分子发生聚集的趋势变大;而锌离子的浓度升高,则对牡蛎肽的电荷屏蔽作用加强,也加大牡蛎肽聚集的程度,这与粒径分析的结果是相吻合的。

2.2.2 牡蛎肽-锌纳米粒的电镜图 由图1可以清楚地观察到纳米粒的形成,且纳米粒的尺寸与粒径分析仪的结果基本一致。粒径分析仪和电镜分析的结果均证实纳米粒的形成。

图1 牡蛎肽-锌纳米粒电镜图Fig.1 TEM images of oyster peptide-zinc nanoparticles 注:A:0.9%硫酸锌,pH11.0;B:0.7%硫酸锌,pH7.0。

2.3 稳定纳米颗粒结构的空间作用力

2.3.1 EDTA对纳米粒稳定的影响 加入EDTA后体系的透光率变化如图2所示。由图2知道,在四种牡蛎肽-锌纳米粒中加入EDTA之后,混合液的透光率均显著升高到81%左右,恢复到各自条件下的牡蛎肽溶液的透光率水平,透射电镜图(图3)呈现无颗粒的弥散状态,说明纳米粒被完全破坏。由此可见锌离子不但参与了牡蛎肽和硫酸锌混合体系形成纳米粒的过程,而且是纳米粒中不可缺少的组分。这与Zhang等[5]研究大豆分离蛋白与钙离子形成纳米粒的结果相一致。

图2 EDTA对纳米粒分散液透光率的影响Fig.2 The influence of EDTA on transmittance of nanopaticle dispertions注:1:0.5%硫酸锌,pH6.0;2:0.6%硫酸锌,pH6.5;3∶0.8%硫酸锌,pH7.0;4:0.9%硫酸锌,pH8.0。图4、图6同。

图3 纳米粒分散液经EDTA处理后的透射电镜图Fig.3 TEM image of nanopaticle dispertion after EDTA treatment

2.3.2 SDS对纳米粒稳定的影响 由图4可知,在四种牡蛎肽-锌纳米粒中加入SDS之后,透光率也显著升高到各自条件下的牡蛎肽溶液的透光率水平,说明纳米颗粒也被完全破坏,透射电镜图也证实纳米粒的消失(图5),这和EDTA实验结果一致。SDS能强烈破坏蛋白质分子间的疏水作用,由此可知疏水作用是牡蛎肽-锌纳米粒形成和稳定的关键空间作用力[17]。

图4 SDS对纳米粒分散液透光率的影响Fig.4 The influence of SDS on transmittance of nanopaticle dispertions

图5 纳米粒分散液经SDS处理后的透射电镜图Fig.5 TEM image of nanopaticle dispertion after SDS treatment

2.3.3 尿素对纳米粒稳定的影响 由图6可知,在四种牡蛎肽锌纳米颗粒中加入尿素之后,透光率显著升高。但是后两种条件下形成的纳米粒加入尿素后其透光率并未升高到牡蛎肽溶液的透光率水平,进一步通过电镜观察发现(图7),纳米粒依然可辨认,但纳米粒的粒径显著降到10 nm以下。可见尿素能一定程度的破坏纳米粒,但却不能使纳米粒完全解体,这与前人的研究结果一致[5-6]。由于尿素能破坏蛋白质分子内部氢键而导致蛋白质分子结构松弛[18]而变性,因此氢键可能参与了纳米粒的形成,但并不是纳米粒稳定的关键作用力。本实验中尿素的氨基也可能与锌离子配位络合,导致纳米粒部分破坏。因此尿素是否是因为破坏氢键而导致纳米粒的破坏还无法确定,还需进一步研究。

图6 尿素对纳米粒分散液透光率的影响Fig.6 The influence of urea on transmittance of nanopaticle dispertions

图7 纳米粒分散液经尿素处理后的透射电镜图Fig.7 TEM image of nanopaticle dispertion after urea treatment

2.3.4 pH对纳米粒稳定的影响 由表4中可以看出在0.7%硫酸锌、pH7.0条件下制得牡蛎肽-锌纳米粒在pH6～8的范围内均是稳定的,透光率稳定在54.6%～64.5%之间。当pH降至5.0以下,出现浑浊现象,说明纳米粒聚集。当pH达到9.0以上,纳米粒被破坏而呈现均匀分散状态,表现为透光率上升。这表明静电相互作用是形成和稳定纳米粒的关键因素。通过与表1比较发现,牡蛎肽-锌纳米粒具有一定的抗pH稳定性。表1中牡蛎肽与0.7%硫酸锌只能在pH6.5～7.0范围内形成纳米粒,但是当形成纳米粒后却能在pH6.0～8.0范围内稳定存在,这说明牡蛎肽锌纳米粒具有一定的稳定结构,其破坏需要克服一定的活化能[19]。

表4 pH对纳米粒分散液透光率的影响Table 4 The influence of pH on transmittance of nanopaticle dispertions

注:√表示纳米粒,×表示没有纳米粒。

3 结论

以往的研究均指出金属离子在肠道中是以离子形式通过小肠粘膜上特定的离子通道而吸收。但近期研究揭示铁离子可以氧化铁纳米粒的形式通过胞吞的方式吸收[2,20],这为纳米型矿物元素补充剂的研究开发提供了理论基础。本论文通过控制硫酸锌的浓度和pH,在牡蛎肽中加入0.5%～0.9%的硫酸锌后,将体系pH调至6.0～11.0,制得了粒径为28～102 nm的牡蛎肽-锌纳米粒,并确定了锌离子是肽-锌纳米粒形成的物质基础,疏水作用和静电相互作用是其稳定的关键作用力,这为纳米型肽-锌补充剂的开发提供了理论依据。

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Formationandstabilizedforceofoysterpeptide-zincnanoparticles

ZHOUCai-yan1,HUANGHai1,2,*,LINa-mei1,HUANGMei-ping1,MOXiao-yun1

(1.College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535011,China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization ofBeibu Gulf Seafood Resource,Qinzhou 535011,China)

To investigate the formation and stabilized force of oyster peptide-zinc nanoparticles,the formation conditions could be preliminary screened by turbidity test and the formation of nanoparticles could be confirmed by particle size analysis and electron microscope observation. The stabilized force could be determined through secondary bond destruction experiments. The results showed that nanoparticles whose diameters ranging from 28～102 nm were formed when 0.5%～0.9% zinc sulfate was added in oyster peptide solvent with pH6.0～11.0. Zinc was an essential component of nanoparticles,hydrophobic force and electrostatic interaction were the key forces for stabling the nanoparticles. Oyster peptide-zinc nanoparticles were expected to become the new zinc supplements.

oyster peptides;nanoparticles;formation;stabilized force

2017-05-22

周采燕(1983-),女,本科,研究方向:水产品加工及资源利用,E-mail:847051579@qq.com。

*通讯作者:黄海(1977-),男,博士,副教授,研究方向:水产品加工及资源利用,E-mail:jxfifagoal@163.com。

广西自然科学基金面上项目(2016GXNSFAA380067);广西高校中青年教师基础能力提升项目(KY2016YB493);国家级大学生创新创业训练计划项目(201611607006)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)23-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.016