李 菁，刘洪娇，张 旭，林思土，贾 茹，于美娥，王 巍

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

大孔树脂分离纯化诃子鞣质的工艺研究*

李 菁，刘洪娇，张 旭，林思土，贾 茹，于美娥，王 巍*

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

本文研究了大孔树脂分离纯化诃子鞣质的方法。先对7种大孔吸附树脂进行静态吸附与解吸性能的考察，进一步对性能相近的HPD600和NKA-9树脂进行动态吸附与洗脱效果比较，选定以NKA-9对诃子鞣质进行分离纯化。优化的工艺条件为：3BV浓度为66.7mg·mL-1的上样液，以1BV·h-1速度通过层析柱，以3BV水洗脱，再以5BV的60%乙醇洗脱，洗脱流速均为3BV·h-1。结果表明，没食子酸和鞣花酸的平均回收率分别为66.05%和84.12%，在干膏中的纯度分别为3.71%和10.38%。经过该工艺纯化后，诃子鞣质得到富集。

诃子；鞣质；大孔树脂；纯化；HPLC

鞣质为一类多元酚类化合物，分为可水解鞣质和缩合鞣质，其中可水解鞣质具有较好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗脂质过氧化等药理作用，是许多常用中药的药效物质基础[1]。诃子是一种传统中药，主产于云南、广西、广东，为藏医和蒙医所常用，被称为“蒙药之王”[2]。诃子鞣质为可水解鞣质，以没食子鞣质和鞣花鞣质为主，经过对诃子鞣质HPLC分析发现，没食子酸可作为极性较大鞣质的代表成分，而鞣花酸属于极性偏小的成分。为了能够得到更多、更纯的诃子鞣质，可以通过控制这两个不同极性代表性成分的含量，对诃子鞣质的收率和纯度进行衡量。本实验以HPLC法测定没食子酸和鞣花酸含量，以此为基础，采用大孔树脂法对诃子鞣质进行纯化，建立最佳纯化工艺。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱系统（美国安捷伦科技公司）；FA1004B分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-500E超声波清洗器（上海精密仪器仪表有限公司）；XMTD7000电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；EURSON优盛电陶炉。

诃子药材经辽宁中医药大学鉴定教研室王添敏老师鉴定，为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果实，产地广西；没食子酸和鞣花酸对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司（含量测定用，纯度＞98%）；甲醇为色谱纯，乙醇、磷酸为分析纯，均购自天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸和鞣花酸的含量测定[3]色谱条件色谱柱：DiamonsilPlusC18-A柱（250×4.6mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）为流动相进行梯度洗脱。0～10min，B 为 98%～90%；10～12min，B 为 90%～52%；12～25min，B 为 48%。检测波长为 270nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1。

对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的没食子酸和鞣花酸对照品适量，分别加甲醇配制成对照品贮备液。精密吸取各贮备液适量，配制得含没食子酸 0.04704mg·mL-1和鞣花酸 0.0558mg·mL-1的混合对照品溶液，备用。

测定方法 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入高校液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积，以外标一点法计算没食子酸和鞣花酸的含量。

1.2.2 总鞣质的提取 取诃子药材200g，砸取果肉，加70%乙醇8倍量，浸泡0.5h，回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压回收乙醇，水浴浓缩至药液无醇味；药渣再以6倍量水提取2次，每次1.5h。醇提后浓缩液与两次水提所得的水提液合并，将总体积浓缩至药材重的10倍量，经台式离心机4000r·min-1离心20min，作为树脂纯化上样液备用。1.2.3 大孔吸附树脂的选择 树脂的预处理取不同型号的树脂，用95%乙醇充分浸泡24h后，用蒸馏水洗至无醇味。分别以4%盐酸溶液3BV冲洗，蒸馏水洗至中性，再以5%氢氧化钠溶液3BV冲洗，蒸馏水洗至中性，抽滤至不滴水，备用[4]。

静态吸附与解吸性能比较 取上述处理后的不同型号树脂各2g，置于50mL具塞锥形瓶中，分别精密加入上样液（生药质量浓度c=100mg·mL-1）10mL，浸泡24 h（时时振摇），待充分吸附后，抽滤至干，滤液作为供试品溶液，测定未被吸附的没食子酸和鞣花酸的量（Q1）。将抽干后的各型号树脂中分别精密加入95%乙醇25mL，浸泡24h（时时振摇），抽滤至干，滤液，作为供试品溶液，测定被吸附后能够被洗脱的没食子酸和鞣花酸的量（Q2）。根据以下公式分别计算不同型号树脂对没食子酸和鞣花酸的吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）。

式中 Q：上样量；Q1：未吸附量；Q2：洗脱量。

动态吸附及洗脱能力考察取经处理的树脂3g（约5mL），装入直径为1cm，长度为30cm的玻璃柱中。分别精密吸取上样液20mL（4BV），控制流速为1.5BV·h-1，收集流出液，测定未被吸附的没食子酸和鞣花酸的量（Q1）；树脂床以 10mL（2BV）水洗，流速控制为 3BV·h-1，收集水洗液，测定水洗脱量（Q2）；树脂床再以 15mL（3BV）60%乙醇洗脱（3BV·h-1），收集醇洗液，测定醇洗脱量（Q3）。分别计算动态情况下树脂对没食子酸和鞣花酸的吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）。

1.2.4 树脂纯化工艺的建立[5,6]

上样浓度考察 精密吸取1.2.2项下的上样液4份，每份20mL，分别做以下处理：（1）水浴浓缩至10mL，使生药浓度为 200mg·mL-1；（2） 保持原浓度不变；（3）加水稀释至 30mL，使生药浓度为 66.7mg·mL-1；（4）加水稀释至40mL，使生药浓度为50mg·mL-1。将4份溶液分别作为上样液，按“动态吸附及洗脱能力考察”项下方法进行试验，考察上样浓度对吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）的影响。

上样液pH值考察 精密吸取上样液3份，分别做以下处理，（1）保持原pH值不变，pH值为3.2；（2）调pH值为2.0；（3）调pH值为1.5。将3份溶液分别作为上样液，按“动态吸附及洗脱能力考察”项下方法进行试验，考察上样pH值对吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）的影响。

动态吸附泄漏曲线绘制 取直径为1cm，长度为30cm的玻璃柱3支，各装入大孔树脂6g（约10mL），以100mL药液上样，分别控制流速为1、2、3BV·h-1，每 1BV（10mL）收集一次，测定各流份中没食子酸和鞣花酸的含量，绘制泄漏曲线，确定最佳上样量及上样速度。

洗脱剂乙醇体积分数考察取上述玻璃柱2支，各装入树脂3g（约5mL），以15mL药液上样，控制流速为1BV·h-1，当药液全部流出后，以2BV水洗。（1）以10%→30%→50%→70%乙醇各3BV洗脱；（2）以20%→40%→60%→80%乙醇各3 BV洗脱，两柱洗脱流速均为3BV·h-1，分别手机各段醇洗脱液，测定。洗脱曲线考察取上述玻璃柱3支，分别装入树脂6g（约 10mL），以 30mL药液上样，流速为 1BV·hL，当药液全部流出后，分别以4BV水洗，再以60%乙醇8BV 洗脱，流速控制为 1、2、3BV·h-1，每 1BV 收集一份洗脱液，测定，绘制洗脱曲线，确定最佳洗脱剂体积及洗脱速度。

1.2.5 工艺验证试验 取直径为1.5cm，长度为30cm的玻璃柱3支，将建立的纯化工艺放大10倍，进行初步验证试验，分别收集水洗液和醇洗脱液，回收溶剂，水浴浓缩至干，冷冻干燥制得干膏，HPLC法测定各干膏中没食子酸和鞣花酸的含量，计算收率及纯度。

2 结果与讨论

2.1 静态吸附与解吸性能比较

考察7种不同极性的大孔吸附树脂对诃子鞣质的吸附与解吸性能，结果表明HPD600和NKA-9对没食子酸和鞣花酸的吸附能力和洗脱能力均较好，回收率均可达80%以上，结果见表1。

表1 静态吸附与解吸性能比较（%）Tab.1 Comparison of static adsorption and desorption performances

2.2 动态吸附及洗脱能力考察

对HPD600和NKA-9两种树脂进行进一步的动态吸附与洗脱性能考察。结果表明，在动态过程中，NKA-9对没食子酸和鞣花酸的回收率优于HPD600，因此，本试验采用NKA-9对诃子鞣质进行纯化，建立纯化工艺。结果见表2。

表2 动态吸附与解吸能力比较（%）Tab.2 Comparison of dynamic adsorption and desorption performances

2.3 上样浓度

考察 4种浓度下的没食子酸吸附率分别为85.36%、74.43%、80.49%、74.69%，鞣花酸的吸附率分别为78.30%、88.22%、93.70%、92.68%；没食子酸的回收率分别为83.18%、74.36%、79.65%、69.87%，鞣花酸的回收率分别为62.98%、83.31%、90.25%、88.19%。可见上样液浓度对没食子酸的吸附率无明显影响，随着上样液浓度变小，鞣花酸的吸附率有增大趋势；随上样液浓度减小，没食子酸的回收率会略有减小，但鞣花酸的回收率却显著增高。根据试验结果，综合考虑，确定上样液为药材提取后药液适当浓缩至药材量15倍体积，即生药浓度为66.7mg·mL-1比较合适。

2.4 上样液pH值考察

由于鞣质自身具有较强的酸性，为保证没食子酸和鞣花酸在树脂纯化过程中不发生离解，需对上样液pH值进行考察。3种pH值条件下没食子酸吸附率分别为81.23%、85.36%、88.49%，鞣花酸的吸附率分别为92.91%、72.14%、63.52%；没食子酸的回收率分别为78.25%、80.86%、82.12%，鞣花酸的回收率分别为90.43%、67.45%、60.36%。可见随上样液pH值减小，没食子酸的吸附率与回收率均略有升高，但鞣花酸的吸附率和回收率均显著降低。由于鞣花酸在化学结构上是由两分子没食子酸缩合而成，上样液酸性增强可能会导致鞣花酸一定程度上的水解，因此在纯化过程中，不宜采用较低的pH值环境，保持原有酸度即可。

2.5 泄漏曲线绘制

比较不同上样速度时的动态吸附性能，绘制吸附泄漏曲线。结果可以看出，由于诃子鞣质自身极性比较大，即使选择极性的大孔树脂，其泄漏还是比较严重，并且上样速度越快，泄漏越快。一般情况下常以10%为泄漏点，超过这个点认为树脂不能对化学成分有较好的吸附。本实验中以极性大的没食子酸和极性相对小的鞣花酸为指标综合考虑树脂的吸附能力，结合两者的实际情况，以鞣花酸泄漏10%、没食子酸泄漏20%为节点，进行方法的确立，选择上样流速为1BV·h-1，上样体积为3BV较为合适。不同流速下的泄漏曲线见图1。

图1 动态吸附泄漏曲线Fig.1 Dynamic adsorption leakage curve

2.6 洗脱剂乙醇体积分数考察

上样后分别以水洗和不同浓度的乙醇洗脱，每1 BV收集1份，计算累积解吸率，结果表明，没食子酸极性较大，上样后用水洗涤，即有70%左右被洗脱下来；鞣花酸水解吸率不高，但可被60%乙醇基本洗脱完全，因此，洗脱溶剂选择先用水洗，再用60%乙醇洗脱。结果见图2。

图2 洗脱剂乙醇体积分数对解吸率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on desorption performances

2.7 洗脱剂曲线考察

由于没食子酸极性较大，试验过程中发现上样后以水冲柱，没食子酸即可被洗脱，因此先后考察水洗用量和醇洗用量。结果表明，3BV水洗后增大洗脱用水量，解吸率没有明显变化，在75%～80%之间；鞣花酸的水解吸率均小于10%，但能够被60%乙醇充分洗脱，当洗脱剂用量为5BV时，解吸率可达94%以上，增大洗脱剂用量解吸率变化不大。比较不同流速下的解吸率，结果表明，洗脱速度对解吸率无显著影响，为节省工时，可选择3BV·h-1。结果见图3。

图3 动态洗脱曲线Fig.3 Dynamic elution curve

2.8 工艺验证试验

根据各试验项目考察结果，确定诃子鞣质树脂分离纯化工艺为：以NKA-9为吸附树脂，上样液浓度为药材重量的15倍体积，上样药液体积为3BV，吸附流速为1BV·h-1，当药液降至树脂床顶端后，以3BV水洗脱，再以5BV的60%乙醇洗脱，洗脱流速均为3BV·h-1。将该工艺放大10倍进行3份平行验证试验，结果没食子酸和鞣花酸的平均回收率分别为66.05%和84.12%，在干膏中的纯度分别为3.71%和10.38%。

3 结论

诃子鞣质中各成分极性差异较大，以没食子酸和鞣花酸为代表。没食子酸在不同型号的大孔树脂上吸附能力相对于鞣花酸都差得多，且非常容易被水洗脱，考虑到实际情况，尽可能兼顾没食子酸和鞣花酸两种成分，在洗脱过程中采用先水洗收集以没食子酸为主的强极性鞣质，再以醇洗脱，收集以鞣花酸为主的弱极性鞣质，其中弱极性鞣质纯化效果较好，而强极性鞣质可能与多糖、无机盐等成分仍然混合，采用其他手段进一步纯化。

通常对鞣质进行纯化工艺研究多采用磷钼钨酸-干酪素法测定总鞣质的含量，本试验采用HPLC法同时测定大极性部分代表成分没食子酸和小极性部分代表成分鞣花酸，通过控制两种成分的含量，进一步衡量诃子鞣质的分离纯化情况，可以减少分光光度法在显色过程中存在的误差，操作更简单，结果更准确。

［1］ 吴玲芳，袁永兵，王坤凤，等.可水解鞣质单体化学与药理作用研究进展［J］.中草药，2014，45（2）：290-299.

［2］ 张峰，杨英，孟萌.诃子在中、蒙、藏医中的应用及比较［J］.中兽医学杂志，2007，（6）：39-41.

［3］ 王巍，温聪聪，解世全，等.HPLC法同时测定诃子中莽草酸、没食子酸及鞣花酸的含量［J］.中华中医药杂志，2017，32（2）：819-821.

［4］ 王凯顺，袁慕华，刘璇，等.大孔树脂富集多舌飞蓬总咖啡酸酯的工艺［J］.精细化工，2017，34（2）：186-190.

［5］ 沈建福，李利敏，吴晓琴.大孔树脂分离纯化油茶蒲鞣质工艺研究［J］.中国食品学报，2013，13（7）：115-121.

［6］ 梁敏，何丽娜，董新荣，等.大孔树脂分离纯化葡萄籽原花青素的研究［J］.化学工程师，2015，234（3）：65-69.

Seperation an purification of tannins from terminalia chebula retz.by macroporous resin*

LI Jing，LIU Hong-jiao，ZHANG Xu，LIN Si-tu,JIA Ru，YU Mei-e,WANG Wei*
（School of Pharmacy,Liaoning University of TCM,Dalian 116600,China）

The method for seperation and purification of tannins from Terminalia chebula Retz.by macroporous resin were studied in this work.Firstly,seven kinds of macroporous resin were screened by studing on static adsorption and desorption properties,HPD600 and NKA-9 were choosed out.Then the dynamic adsorption and elution performances were compared between HPD600 and NKA-9,and NKA-9 was chosen as the purification macroporous resin of tannins of Terminalia chebula Retz..Finally,the optimum pruification conditions were determined as follows:3BV of 66.7mg·mL-1sample liquid was flowed through NKA-9 resin column at a speed of 1BV·h-1,then the adsorption tannins could be eluted successively with 3BV of H2O and 5 BV of 60%ethanol at 3BV·h-1.After purification,the average recovery rate of gallic acid and ellagic acid was 66.05%and 84.12%,the purity in dry paste was 3.71%and 10.38%respectively.After treatment with macroporous resin NKA-9,the tannins of Terminalia chebula Retz.were enriched.

terminalia chebula retz.;tannins;macroporous resin;seperation and purification;HPLC

R284.1

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171115

2017-07-27

辽宁省博士启动基金（NO.201501097）；辽宁中医药大学大学生创新创业训练计划项目（No.201610162092）

李 菁（1995-），女，辽宁中医药大学，中药学专业，在读本科生。

王 巍（1979-），女，博士，副教授，主要从事中药质量评价及新药开发研究。