高圣博，辛嘉英,2*，窦博鑫，李春雨，张 伟

（1.哈尔滨商业大学 食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院 兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000）

科研与开发

甲烷氧化菌素催化二价汞还原的研究*

高圣博1，辛嘉英1,2*，窦博鑫1，李春雨1，张 伟1

（1.哈尔滨商业大学 食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院 兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000）

甲烷氧化菌素（Methanobactin,Mb）是由甲烷氧化细菌分泌到细胞外的小分子荧光肽，同时也具有金属鳌合的生物特性可将自然界中的Hg（II）还原成Hg（0）吸附于细胞表面且不挥发。甲烷氧化菌具有在高汞离子浓度环境下的耐受性，具有清除环境中汞的能力。Mb能完成多种生理功能，包括汞的吸附以及汞的解毒。本文以甲基弯菌（Methylosinus trichosporium）IMV3011发酵液为原料，使用大孔树脂HP-20对其进行分离纯化获得Mb，分析Mb在细胞外与汞的特异性结合以及是否受到铜离子干扰，确定Mb纯化后与汞的结合的反应时间为5min，结合摩尔比为2∶1，汞的吸附率达70%。最佳发酵碳源为甲烷，最佳发酵周期为5d。通过细胞生长曲线确定细胞耐受汞离子浓度为15umol·L-1，汞离子的存在使细胞生长的延滞期变长，对数生长期减小，最大比生长速率降低。

甲烷氧化菌素；金属螯合性；细胞生长曲线

随着工业发展，从生产废料中释放出来的汞，被土壤吸附后经过微生物过渡性吸收进入食物链，汞作为持续性污染物难以在自然界中降解、消失[1,2]。水中汞的污染来自大气及工农业生产，大量的汞和氯化汞从废水中排出，沉积于水底，而沉积于水底的汞离子，在厌氧细菌和甲基维生素B12的作用下形成甲基汞和乙基汞，这些汞的化合物在海产品体内富集，形成高浓度，人或动物食用后会引起汞中毒[3-5]。闻名遐迩的日本公害水俣病就是长期饮用含汞水和含汞产品所致[6]重金属具有毒性大、生物富集性强、不可自然降解及来源复杂等特点[7,8]，对生态环境造成了严重的危害，其中以汞污染带来的危害最为严重[9,10]。

本研究拟采用甲烷氧化菌素催化二价汞还原，这与传统的化学法相比，具有干净、无毒和环境友好的优点[11,12]。在单因素的基础上利用细胞生长动力学模型通过紫外-可见光分光光度法测细胞吸光度，对细胞生长以及耐受汞浓度进行研究[13,14]。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

甲基弯菌（Methylosinus trichosporium）IMV3011（俄罗斯科学院催化研究所）；Diaion HP-20大孔吸附树脂（日本三菱化工公司），1.1cm×20cm层析柱。甲烷（北京海普气体有限公司）；KH2PO4·7H2O（天津市东丽天大化学试剂厂）；KNO3，Na2HPO4·12 H2O，K2HPO4，FeCl3，FeSO4·6H2O（天津市天力化学试剂有限公司）；CaCl2·2H2O，MnSO4·H2O，NH4Cl，NaCl（天津市风船化学试剂有限公司）；NaH2PO4·2H2O（天津市津东天正精细化工试剂厂）；MgSO4·7H2O（天津市光复科技发展有限公司）；ZnSO4·7H2O（天津市永大化学试剂有限公司）。

1.2 主要实验仪器

UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；2-16K高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；BS210S电子天平（德国Sartorius仪器公司）；RV8V旋转蒸发仪（德国IKA公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；5BG-生化发酵罐（上海保兴生物设备工程公司）；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 甲烷氧化菌素还原与结合Hg（II） 按表1培养基配制方法，配3L培养基置于发酵罐中，高压蒸汽灭菌（121℃、0.1MPa、30min），置于超净工作台紫外杀菌20min并冷却至室温。培养温度为30℃，转速 180r·min-1。通入甲烷与空气为 1∶（V/V）的混合气体，培养周期为3d。将发酵液置于4℃、8000r·min-1冷冻离心机中离心20min，取上清液通过HP-20进行静态吸附，旋转蒸发得到纯化的Mb。将Mb置于一次性标准比色皿中（约3.5mL）进行紫外全波长扫描后向其中滴加0.01mol·L-1HgCl2溶液，通过紫外全波长扫描观察波长298nm处吸收峰的变化。

表1 甲基弯菌IMV 3011限铜无机盐培养基Tab.1 Methylphenyl fungus IMV 3011 copper limited inorganic salt medium

1.3.2 汞的标准曲线的测定 Hg2+在波长230nm处有最大吸收，用双硫腙-四氯化碳溶液自水相中萃取汞，再用（4～6N）HCl将汞反萃入水相，并用紫外分光光度法测量。二价汞的标准溶液：0.1357g HgCl2用蒸馏水冲稀至1000mL得到100μg·mL-1标准溶液。

标准曲线制备：在50mL容量瓶中加入一定量的二价汞的标准溶液，用6N HCL配置成每毫升含1.0、3.0、5.0、7.0μg的二价汞溶液，在波长 230nm 处用6N HCl为参比液测量吸光度并绘制标准曲线，公式如下：

式子 V1：反萃时所用盐酸体积，mL；V2：水样体积，mL。

1.3.3 细胞生长动力学模型 经过反复试验发现甲烷氧化菌细胞生长曲线与Logistic模型接近，基于上述分析，为了更准确方便的考察甲烷氧化菌细胞生长规律，为后续甲烷氧化菌对汞离子的耐受程度奠定基础，建立如下基于Logistic模型的积分表达形式：

式中 A2：发酵液初始浓度；A1：发酵液最大浓度；P：细胞生长指数；X0：最大生长速率比例常数；X：细胞生长时间；y：细胞浓度（用OD600表示）。

2 结果与讨论

2.1 培养中碳源的筛选

以甲醇为碳源进行培养：100mL灭菌培养基，以10%接种量接种；在每天（/d）补加0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%，0.5%（V/V）浓度甲醇的培养基中分别培养细胞96-144h通过树脂吸附分离纯化后通过旋转蒸发得到Mb进行紫外全波长扫描。以甲烷为碳源进行培养：发酵罐内装100mL灭菌的无机盐培养基，以10%接种量接种定容至1L；30°C 恒温 180r·min-1培养；V（甲烷）∶V（空气）=1∶1；培养时间：96～144h；每隔24h换气，通过树脂吸附纯化通过旋转蒸发得到Mb进行紫外全波长扫描。

图1为不同种类的碳源对Mb的提取纯化及活性影响。

图1 不同碳源培养对Mb活性的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on Mb activity

由图1可知，在相同的反应条件下，甲烷培养的效果比甲醇效果要好。可能是因为甲烷与发酵液的震荡培养促使反应接触更充分，从而Mb活性更强，因此选取甲烷作为发酵培养的碳源。

2.3 影响甲烷氧化菌素催化二价汞还原反应的因素

2.3.1 反应时间的影响 确定最佳的反应时间可以避免实验时间浪费，从而提高工作效率。将Mb加入标准比色皿中（约为3.5mL）加入0.01μmol的氯化汞溶液在常温下进行反应，每隔1min对反应溶液进行一次紫外-可见全波长扫描，通过测定Mb在298nm处特征吸收峰所对应的吸光度值的变化从而确定体系反应时间。

研究应时间对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响，结果见图2。

图2 反应时间对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响Fig.2 Effect of eeaction time on reduction of divalent mercury by methoxycotein

由图2可知，随着Mb与二价汞反应的进行，0～5min内298nm处的吸光度值逐渐降低，5～10min后298nm处吸光度值基本保持不变且反应至5min后吸光度值达到最低保持稳定，此时证明Mb与二价汞结合完全，因此，Mb与二价汞的反应时间为5min。

2.3.2 反应温度的影响 Mb作为生物酶有其适宜的催化温度范围，因此，温度也是影响酶催化反应的重要因素之一。控制其他反应条件不变，将反应至于：20、30、40、50、60、70℃下进行反应，将反应液进行紫外-可见全波长扫描，通过测定Mb在298nm处特征吸收峰所对应的吸光度值的变化从而确定体系最佳反应温度。

研究反应温度对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响，结果见图3。

图3 反应温度对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on reduction of divalent mercury by methoxycotein

由图3可知，当温度从15℃至30℃变化时，吸光度值呈上升趋势。在30℃时达到最高。这是因为升高温度可以使发酵液与甲烷反应更充分，达到甲烷氧化菌生长最适温度，生长速率加快分泌Mb旺盛，使得吸光度值升高。但当温度超过30℃时，吸光度值下降。可能是因为Mb作为生物剂，有其适宜的催化温度范围，温度过高则会导致酶结构发生变化而失去催化活性。因此，30℃为最佳温度，并用于以后的反应。

2.3.3 汞的添加量的影响 研究汞的添加量对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响，结果见图4。

图4 汞的添加量对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响Fig.4 Effect of mercury addition on reduction of divalent mercury by methoxycotein

由图4可知，汞的添加量从0μL到10μL变化时，随着汞用量的增加，298nm处吸光度成下降趋势，在7μL时下降到最低，吸光度为1.415。这是因为Mb具有金属螯合性，Mb将溶液中二价汞离子还原成单质汞并吸附于细胞表面使吸光度值降低。但随着汞的量继续添加，添加至7μL时吸光度保持稳定。这是可能是因为汞的添加量过大，造成Mb对二价汞的还原达到饱和，导致吸光度保持稳定。

2.3.4 Mb的影响 向2.3.3反应中逐渐滴加少量的Mb，观察298nm处吸光度值的变化，结果见图5。

图5 Mb的添加量对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响Fig.5 Effect of the addition amount of Mb on the reduction of divalent mercury by methane oxidizing

由图5可知，在2.3.3反应稳定时向反应体系中逐渐滴加Mb，吸光度由1.415处开始呈上升趋势。综合图4、5可以得知，Mb具有金属螯合性可将二价汞吸附于细胞表面不挥发。确定Mb在捕获和还原二价汞的过程中起到关键性作用。

2.3.5 Cu2+的影响 在标准比色皿中加入3.5mL Mb和0.01mol·L-1的HgCl2溶液反应完全，而后加入0～8μL（0.008mol·L-1）CuSO4，研究 Cu2+对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响，结果见图6。

图6 Cu2+对甲烷氧化菌素还原二价汞的影响Fig.6 Effect of Copper Ions on Reduction of Divalent Mercury by Methoxycotracycline

由图6可知，加入0～4μL（0.008mol·L-1）CuSO4，吸光度呈上升趋势，在加入4μL时上升至最高说明相对于汞离子，Mb与铜离子亲和性更强。但加入4μL之后，随着反应的进行，吸光度呈下降趋势。这是因为铜离子和Mb的结合是一个可逆反应，随着反应的进行，Mb对汞进行吸附结合，从而使吸光度开始下降。

从图4和6可以看出，铜捕获和还原Mb的能力比汞的捕获和还原的能力强，但是铜还原Mb的过程可逆，汞还原Mb的过程不可逆。在3.5mL Mb中滴加至 7μL的 Hg（0.01mol·L-1）时反应终止达到稳定，且为不可逆反应并且此时Mb的浓度可通过Cu与Mb1∶1互相结合，通过Cu的添加量来进行比对，即为 Cu（0.008mol·L-1）时滴加 4μL时的浓度。此时Mb浓度为：9.14×10-6mol·L-1。那么此时Mb与Hg（0.01mol·L-1）约为 2∶1 结合。

2.4 甲烷氧化菌生长动力学模型的建立及验证

2.4.1 甲烷氧化菌的细胞生长曲线 研究微生物群体在限制性条件下的增长规律时，生长模型的构建具有重要的意义。生长动力学模型很多，其中描述微生物种群数量随时间变化的Logistic模型能较好的拟合发酵过程的甲烷氧化菌体的生长规律。

延滞期（λ）和最大比生长速率（μmax）是反映微生物生长动力学的重要参数，对这两个参数采用下述方法确定：做细胞对数生长阶段曲线的切线，该切线的斜率即为最大比生长速率（μmax）。再从接种时底物中的细胞浓度点引平行时间轴直线，与切线交于一点，由该点做时间轴垂线，交生长曲线一点，这点即为菌体开始迅速生长繁殖的始点，该点对应的时间即为延滞期（λ），见图 7。

通过生长模型发现：发酵开始时，菌体浓度很低，微生物的个体逐渐增大且数目不变，处于延滞期；菌体适应环境后，进行迅速繁殖，微生物进入对数生长期；最后进入稳定期，底物量减少，微生物的有毒代谢物积累，生长率相对对数生长阶段呈下降趋势。由此分析甲烷氧化菌的生长规律，观察二价汞对细胞的延滞期，对数生长期，最大比生长速率的影响，以及铜离子对细胞生长各参数的影响。

图7 微生物生长曲线Fig.7 Microbial growth curve

2.4.2 甲烷氧化菌生长动力学模型的求解 模型（表2）有四个参数，根据实验数据，以误差平方和最小为限制条件，计算获得待估参数，应用matlab程序进行拟合。根据发酵实验数据逐步迭代进行拟合处理，不断修正模型参数的初估值，得到模型中的各个参数，并用切线法作图得到延滞期和最大比生长速率见表3。

表2 动力学模型的参数和重要特征值Tab.2 Parameters and important characteristic value of kinetic model

表3 培养基中Cu2+浓度对细胞生长的影响Tab.3 Influence of different Cu2+concentration on

2.4.3 甲烷氧化菌生长动力学模型的验证 将上述理论计算模型代入试验数据，得出结果见图8。

图8 细胞生长模型回归曲线与实验数据比较Fig.8 Comparison of Cell growth model regression curve and experimental data

从拟合结果来看，理论模型和实际试验结果符合较好，因此，适用于甲烷氧化菌的发酵以及后续细胞生长曲线和特征值动力学模型的拟合。

2.4.4 Hg2+浓度对细胞生长的影响 Hg2+浓度对甲烷氧化菌生长情况的影响，拟合曲线如图9和表3。

在培养基中添加浓度低于15μmol·L-1的Hg2+，甲烷氧化菌的生长都能生长，表现在最大比生长速率和发酵终止时OD600值都在正常生长区间内。这是由于甲烷氧化菌会分泌一种叫methanobactin的小分子荧光色素肽来捕获环境中的微量Hg2+，使细胞生长暂缓，延滞期较长。然而高Hg2+浓度对甲烷氧化菌有毒害作用。添加更高浓度的Hg2+将抑制细胞生长，细胞生长速率下降。这与我们的研究结果一致。

图9 培养基中Hg2+浓度对细胞生长的吸光度拟合曲线Fig.9 Absorbance curve of Hg2+concentration in the culture medium for cell growth

2.4.5 Cu2+浓度对细胞生长的影响 Cu2+在甲烷氧化菌的代谢过程中扮演着重要的生物学角色，Cu2+浓度决定了甲烷氧化菌的甲烷氧化速度和生物催化转化行为。Cu2+浓度影响着甲烷氧化菌的生长、以及对所得细胞的MMO活性具有调控作用。

甲烷氧化菌生长情况的影响，拟合曲线如图10和表3。在培养基中添加浓度低于30μmol·L-1的Cu2+，对甲烷氧化菌的生长有促进作用，表现在最大比生长速率和发酵终止时OD600值都大于无Cu2+培养；适当浓度Cu2+的添加，能刺激甲烷氧化菌中甲醛脱氢酶的表达，从而促进细胞生长；在限Cu2+的培养条件下，甲烷氧化菌会向细胞外分泌Mb来捕获环境中的微量Cu2+，使细胞生长缓慢，延滞期变长；而添加更高浓度的Cu2+将抑制细胞生长，细胞生长速率下降。

图10 培养基中Cu2+浓度对细胞生长的吸光度拟合曲线Fig.10 Absorbance fitting curves for cell growth at different Cu2+concentration

3 结论

本文研究了不同碳源对甲烷氧化菌素催化效果，筛选了适合发酵培养中最适碳源，考察了影响甲烷氧化菌素还原二价汞反应的因素，通过紫外全波长扫描分析，确定Mb在捕获和还原二价汞的过程中起到关键性作用，得到甲烷作为发酵碳源，发酵时间为5d，反应温度为30℃，反应时间为5min，Mb与汞的结合摩尔比为2∶1，汞的吸附率达70%。通过甲烷氧化菌生长动力学模型细胞生长曲线，得知细胞耐受汞离子浓度为 15μmol·L-1，Hg2+的存在使细胞生长的延滞期变长，对数生长期减小，最大比生长速率降低。铜离子的存在影响Mb催化还原二价汞，汞与Mb的结合具有不可逆性，为今后环境中汞离子的去除奠定了基础。

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Study on catalytic reduction of divalent mercury by methoxycotin*

GAO Sheng-bo1，XIN Jia-ying1,2*，DOU Bo-xin1，LI Chun-yu1，ZHANG Wei1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076，China；2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China）

Methanobactin（Mb）is a small molecule fluorescent peptide secreted by methane oxidizing bacteria into the cell,and also has the biological properties of metal chelation to restore Hg （II）in nature to Hg （0）Cell surface and not volatile.Methane oxidizing bacteria has the ability to tolerate mercury in the environment with high mercury ion concentration.Mb can perform a variety of physiological functions,including mercury adsorption and mercury detoxification.In this paper,methyl bromide（Methylosinus trichosporium）IMV3011 fermentation broth was used as raw material and purified by macroporous resin HP-20 to obtain Mb.The specific binding of Mb to extracellular and mercury was analyzed and whether copper ions were interfered with The reaction time of Mb purification with mercury was 5 min,the molar ratio was 2∶1,and the adsorption rate of mercury was 70%.The best fermentation carbon source is methane,the best fermentation cycle is 5 days.The cell growth curve was used to determine the concentration of mercury ion at 15umol·L-1.The presence of mercury ions prolonged the growth of cell growth,decreased the logarithmic growth phase and decreased the maximum specific growth rate.

methanobactin；metal chelate；cell growth curve

O643.32

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171101

2017-07-21

国家自然科学基金项目（21073050）（2015年羰基合成与选择氧化国家重点实验室开放课题）

高圣博（1993-），男，哈尔滨商业大学在读硕士研究生，农产品加工及贮藏工程专业。

导师简介：辛嘉英（1966-），男，博士，龙江学者特聘教授，博士生导师。