郭子梦，吴庆文，陈秀秀，关亚丽，李鹏飞，王妍，程月发

丁苯酞通过混合谱系激酶3信号通路对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

郭子梦1，吴庆文1，陈秀秀1，关亚丽2，李鹏飞2，王妍2，程月发2

目的 探讨丁苯酞对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞混合谱系激酶3(MLK3)通路的影响，及其对细胞增殖与凋亡的作用机制。方法 对数生长期SH-SY5Y细胞分为对照组、MPP+组、丁苯酞组和URMC-099组，对照组正常培养，MPP+组加1 mmol/L MPP+培养24 h，丁苯酞组予10µmol/L丁苯酞预处理3 h后，加入MPP+培养24 h，URMC-099组予200 nmol/L MLK3通路特异性抑制剂URMC-099预处理3 h后，加入MPP+培养24 h。倒置相差显微镜观察细胞形态，噻唑蓝比色法检测细胞活性，Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率，Hoechst33342荧光染色法观察凋亡细胞，Western blotting检测MLK3磷酸化蛋白(p-MLK3)、c-Jun氨基末端激酶磷酸化蛋白(p-JNK)和细胞外调节蛋白激酶磷酸化蛋白(p-ERK1/2)的表达。结果 MPP+组细胞存活率低于对照组(p＜0.05)，丁苯酞组和URMC-099组细胞存活率高于MPP+组(p＜0.05)；MPP+组细胞凋亡率高于对照组(p＜0.05)，丁苯酞组和URMC-099组细胞凋亡率低于MPP+组(p＜0.05)；与对照组相比，MPP+组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量增加(p＜0.05)，p-ERK1/2蛋白表达量降低(p＜0.05)；与MPP+组相比，丁苯酞组和URMC-099组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量降低(p＜0.05)，p-ERK1/2蛋白表达量升高(p＜0.05)。结论 丁苯酞可减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，促进细胞增殖，其机制可能是通过抑制MLK3通路，调节下游p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达。

帕金森病；丁苯酞；混合谱系激酶3；凋亡；SH-SY5Y细胞

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征主要为黑质纹状体多巴胺能神经元大量丢失及嗜酸性包涵体形成[1]。帕金森病的病因和发病机制可能与线粒体功能失调、氧化应激、免疫炎症和泛素-蛋白酶系统损伤[2-4]及同核转录相关因子如p53和miR-34a等有关[5-6]。

1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridin-iumion,MPP+)是 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)的有效成分，可选择性破坏中脑黑质多巴胺能神经元，引起细胞凋亡。MPP+已广泛用于诱导帕金森病实验模型，作用机制与p53、Bax、Bcl-2、caspase家族、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族等有关[7]。

URMC-099是混合谱系激酶3(mixed-lineage kinase 3,MLK3)通路特异性抑制剂，可减少炎症反应，保护神经细胞，其机制与抑制MLK3、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化蛋白的表达，减少白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达有关[8]。

丁苯酞是从芹菜籽提取的脂溶性物质，临床广泛用于治疗缺血性脑血管病、帕金森病、阿尔茨海默病等脑疾病。丁苯酞可改善脑组织微循环，抑制炎症，改善认知功能，且副作用少[9]。有文献报道[10]，丁苯酞可抑制JNK通路，降低Fas配体、活化型caspase-3蛋白表达。本研究探讨丁苯酞对其上游通路MLK3的影响，及其对下游JNK通路和细胞外调节蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinases,ERK)通路的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SH-SY5Y细胞株：中国科学院上海细胞生物学研究所。

丁苯酞(批号201502)：中国食品药品检定研究院。MPP+(批号 014M4704V)、Hoechst33342(批号20141017)：美国SIGMA公司。URMC-099(批号S734301)：美国SELLECK公司。胎牛血清和胰酶：美国BI公司。DMEM/F12 1∶1培养基：美国CORNING公司。p-JNK、p-ERK1/2、p-MLK3抗体：美国AFFINITY公司。GAPDH抗体：杭州华安生物技术有限公司。AnnexinV/PI试剂盒：美国BD公司。噻唑蓝：日本TCI公司。BCA蛋白定量检测试剂盒和RIPA裂解液：北京索莱宝公司。

CO2培养箱：美国THERMO FISHER公司。酶标仪：意大利BIO-RAD公司。超净工作台：中国苏州净化设备厂。流式细胞仪：美国BD公司。倒置相差显微镜和荧光显微镜：日本OLYMPUS公司。低温离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

将SH-SY5Y细胞接种于培养瓶，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。细胞处于对数生长期时，胰酶消化传代，2～3 d更换培养基。

取对数生长期细胞，分为正常对照组(细胞正常培养，不加药物干预)、MPP+组(加1 mmol/L MPP+培养24 h)、丁苯酞组(10µmol/L丁苯酞预培养3 h后，加入MPP+培养24 h)、URMC-099组(200 nmol/L URMC-099培养3 h后，加入MPP+培养24 h)。倒置相差显微镜观察细胞形态。

1.2.2 细胞存活率

待细胞贴壁后，每孔1×104细胞接种于96孔板。继续培养24 h，按分组药物处理细胞。加入50 mg/ml噻唑蓝20µl，孵育3 h。弃去培养基，加入二甲基亚砜150µl，摇床10 min。酶标仪490 nm波长检测吸光度值(A值)，计算细胞存活率。

重复3次。

1.2.3 细胞凋亡率

细胞每孔5×105接种于6孔板。待细胞贴壁后，继续培养24 h，按分组药物处理细胞。胰酶消化后收集细胞，PBS缓冲液洗涤3次后弃上清，加入Binding Buffer 400µl制备单细胞悬液，取单细胞悬液100µl，加入Annexin-FITC 5µl混匀，室温避光孵育15 min后，加入Propidium Iodide 5µl混匀。流式细胞仪检测。重复3次。

1.2.4 Hoechst33342染色

细胞以每孔5×105接种于6孔板。待细胞贴壁后，继续培养24 h，按分组药物处理细胞。弃去培养基，PBS缓冲液洗2次，加入4%多聚甲醛溶液1 ml固定10 min；PBS缓冲液洗2次后，加入10µg/ml Hoechst33342荧光染液，37℃避光孵育15 min，荧光显微镜下观察。

1.2.5 Western blotting

图1 各组细胞形态学特征(倒置相差显微镜,200×)

细胞每孔5×105接种于6孔板。待细胞贴壁后，继续培养24 h，按分组药物处理细胞。用冷PBS缓冲液洗2次，每孔加入裂解液100µl冰上裂解30 min；移入离心管，超声打碎，收集细胞，吸取上清液，BCA法测蛋白浓度。蛋白变性，SDS-PAGE电泳，湿转转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。加p-MLK3(1∶1000)、p-JNK(1∶500)、p-ERK1/2(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)一抗4℃摇床过夜。TBST缓冲液洗3次，每次8 min。加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶5000)，室温孵育2 h。TBST缓冲液洗3次，ECL显色，用Image J软件分析条带灰度值，用内参GAPDH进行校准，计算各组蛋白相对表达含量。重复3次，取均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用(xˉ±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 形态学

对照组细胞呈三角形或梭形，贴壁细胞数较多；MPP+组贴壁细胞数减少，细胞变圆，突起结构回缩；丁苯酞组、URMC-099组较MPP+组贴壁细胞增多，细胞突起明显，与对照组形态相似。见图1。

2.2 细胞存活率

与对照组比较，MPP+组细胞存活率降低(p＜0.05)；与MPP+组比较，丁苯酞组和URMC-099组细胞相对存活率升高(p＜0.05)。见表1。

2.3 细胞凋亡率

与对照组比较，MPP+组细胞凋亡率升高(p＜0.05)；与MPP+组比较，丁苯酞组和URMC-099组细胞凋亡率降低(p＜0.05)。见表1、图2。

2.4 Hoechst33342染色

对照组细胞核呈弥漫均匀蓝色荧光；MPP+组细胞染色不均匀，可见浓染致密的颗粒荧光及块状荧光，表示细胞核固缩、碎裂；丁苯酞组和URMC-099组凋亡细胞较少。见图3。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

表1 各组SH-SY5Y细胞存活率和凋亡率比较(%)

图3 各组细胞凋亡情况(Hoechst33342荧光染色，200×)

2.5 Western blotting

与对照组比较，MPP+组p-MLK3和p-JNK表达升高，p-ERK1/2表达降低(p＜0.05)；与MPP+组比较，丁苯酞组和URMC-099组p-MLK3、p-JNK表达降低，p-ERK1/2表达升高(p＜0.05)。见表2、图4。

图4 各组Western blotting结果

表2 各组p-MLK3、p-JNK、p-ERK1/2蛋白相对表达量

3 讨论

本研究采用MPP+诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型，以MLK3通路抑制剂URMC-099为对照，研究丁苯酞治疗帕金森病的作用机制。结果显示，丁苯酞预处理后，细胞形态、存活率、凋亡率和p-MLK3及下游蛋白表达有显著变化。

MLK3广泛表达于人体组织中，是MAPK家族重要的上游信号分子，在神经变性疾病中参与诱导神经细胞凋亡[12]。MLK3参与多种信号级联反应，可激活p38MAPK途径介导caspase-3活化，也可激活JNK通路抑制ERK通路，引起凋亡级联反应[13-14]。

JNK和ERK1/2都位于MLK3下游，两者生物学效应并不相同[15]。ERK1/2磷酸化是功能活动的标志，ERK1/2信号通路激活可减少α-突触核蛋白引起的神经元损伤，在多巴胺神经元急性氧化损伤中起保护作用[16]。张弛等[17]用MPP+诱导多巴胺神经元细胞，发现激活ERK通路可降低MPP+神经毒性。JNK激活后称为p-JNK，可活化核内c-Jun，介导caspase-3，增加Bax蛋白表达，促进细胞色素C释放，诱导神经细胞凋亡[18]。潘静等[19]通过6-羟基多巴胺诱导帕金森病大鼠模型，发现p-MLK3、p-JNK蛋白表达增加；MLK3通路抑制剂可减少MLK3和JNK磷酸化水平，保护多巴胺神经元，改善大鼠旋转行为。

本研究首次探讨MLK3通路在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用机制，结果显示，使用MLK3通路抑制剂URMC-099后，可改善细胞形态，提高细胞存活率，减少细胞凋亡，提示URMC-099具有神经保护作用。这与Marker等[20]研究结果一致。URMC-099可使p-MLK3及下游因子p-JNK蛋白表达减少，p-ERK1/2蛋白表达增加。

丁苯酞是一种多靶点神经保护性药，可阻止神经元退化，有效延缓疾病进程，减轻疾病引起的残疾水平[21]，其神经保护作用机制与保护线粒体功能、抑制氧化应激和炎症反应、减少神经细胞凋亡、适度提高自噬水平有关[22-24]。我们早期的研究发现，对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞，丁苯酞预处理可维持细胞正常形态和良好活性，逆转MPP+诱导的细胞凋亡，与下调p53、Bax和p-JNK蛋白表达水平，维持线粒体膜稳定性，减少细胞色素C的释放[25-27]，适度上调自噬水平，防止细胞继发性损伤有关[28]。

本研究进一步显示，丁苯酞预处理后，细胞形态明显改善，数量增加，细胞活性提高，凋亡率下降，p-MLK3、p-JNK蛋白表达显著降低，p-ERK1/2蛋白表达显著增高，与使用URMC-099预处理的细胞大体相同。本研究中p-JNK的变化与我们早期研究结果一致[27]。

综上所述，丁苯酞影响MPP+诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡，对神经元有保护作用；其机制与抑制MLK3通路、调节促活通路的ERK和促凋亡通路的JNK有关。由于细胞实验的局限性，对丁苯酞在临床上防治帕金森病的作用机制仍需深入研究。

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Effects of DL-3-n-Butylphthalide on Proliferation and Apoptosis of 1-Methyl-4-Phenylpyridinium-induced SH-SY5Y Cells via Mixed Lineage Kinase 3 Signaling Pathway

GUO Zi-meng1,WU Qing-wen1,CHEN Xiu-xiu1,GUAN Ya-li2,LI Peng-fei2,WANG Yan2,CHENG Yue-fa2
1.College of Nursing and Rehabilitation,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063210,China;2.Jitang College of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063210,China

WU Qing-wen,CHENG Yue-fa.E-mail:wxywqw@163.com(WU Qing-wen);arthurcy@163.com(CHENG Yue-fa)

Objective To investigate the effects of DL-3-n-Butylphthalide(NBP)on proliferation and apoptosis of 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)-induced SH-SY5Y cells,and mechanisms via mixed lineage kinase 3(MLK3)signaling pathway.Methods The SH-SY5Y cells were divided into control group,MPP+group,NBP group and URMC-099 group,that cultured normally,with 1 mmol/L MPP+for 24 hours,with 10µmol/L NBP for 3 hours and then with MPP+for 24 hours,and with 200 nmol/L MLK3 inhibitor URMC-099 for 3 hours and then with MPP+for 24 hours,respectively.The morphology of SH-SY5Y cells was observed under inverted phase contrast microscope and the survival rate was measured with 3-(4,5-Cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assays.The apoptosis was quantified under flow cytometry with Annexin V/PI fluorescence staining,and the nuclear morphology was observed with Hoechst 33342 staining.The expression of phosphorylated protein of MLK3(p-MLK3),c-Jun N-terminal kinase(p-JNK),extra cellular regulated protein kinases(p-ERK1/2)were detected with Western blotting.Results Compared with the control group,the survival rate reduced and apoptosis increased in MPP+group(p＜0.05),with the increase of p-MLK3 and p-JNK and decrease of p-ERK1/2 d(p＜0.05).Compared with MPP+group,the survival rate increased and apoptosis reduced in both NBP and URMC-099 groups(p＜0.05),with the decrease of p-MLK3 and p-JNK and increase of p-ERK1/2(p＜0.05).Conclusion NBP can decrease the apoptosis and promote the proliferation of SH-SY5Y cells in-duced by MPP+,which may be associated with inhibiting MLK3 signaling pathway,and regulating the downstream p-JNK and p-ERK1/2.

Parkinson's disease;DL-3-n-butylphthalide;mixed-lineage kinase 3;apoptosis;SH-SY5Y cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.009

1.华北理工大学研究生创新项目(No.2017S37)；2.华北理工大学博士科研启动基金项目(No.35647699)；3.河北省高等学校科学研究青年基金项目(No.QN201722)。

1.华北理工大学护理与康复学院，河北唐山市063210；2.华北理工大学冀唐学院，河北唐山市063210。作者简介：郭子梦(1990-)，女，汉族，河北新乐市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：吴庆文、程月发。E-mail:wxywqw@163.com(吴庆文)；arthurcy@163.com(程月发)。

R742.5

A

1006-9771(2017)11-1284-06

[本文著录格式] 郭子梦，吴庆文，陈秀秀，等.丁苯酞通过混合谱系激酶3信号通路对1-甲基-4苯基-吡啶离子诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(11):1284-1289.

CITED AS:Guo ZM,Wu QW,Chen XX,et al.Effects of DL-3-n-butylphthalide on proliferation and apoptosis of 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced SH-SY5Y cells via mixed lineage kinase 3 signaling pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1284-1289.

2017-06-12

2017-07-26)