陆永嘉，严隽陶，马书杰，陶然，马颖，史智君，孔亚敏，王春红

推拿手法联合跑台训练对坐骨神经延期缝合大鼠神经再生的效果

陆永嘉1，严隽陶1，马书杰2，陶然2，马颖1，史智君1，孔亚敏1，王春红1

目的 探讨推拿手法联合跑台训练对坐骨神经横断伤延期外膜修复后促进神经再生的效果。方法 60只Sprague-Dawley大鼠随机等分为对照组、模型组和治疗组。后两组建立坐骨神经横断伤延期外膜缝合模型，治疗组给予捏法推拿及跑台训练，每天1次。分别于干预后1个月、2个月各取10只大鼠检测坐骨神经运动神经传导速度(MCV)、再生神经轴突数及施万细胞数，电镜观察超微结构。结果 与模型组比较，治疗组MCV在干预后2个月加快(p＜0.05)，轴突数无显著性差异(P＞0.05)，施万细胞数增加(p＜0.05)，电镜下损伤较轻。结论 推拿手法联合跑台训练可促进损伤的周围神经再生。

坐骨神经；神经再生；推拿；跑台训练；大鼠

周围神经损伤是临床常见病，临床表现为运动障碍和不同程度感觉障碍。周围神经损伤的治疗主要是促进神经再生，延缓骨骼肌萎缩。临床由于受诸多因素影响，部分周围神经损伤患者很难得到Ⅰ期神经修复，常需等到条件允许或神经损伤程度及范围确定后，才能进行Ⅱ期神经修复[1]。传统中医推拿手法及主动运动都是重要的神经康复方法，广泛应用于临床。推拿手法对神经损伤后恢复早期有一定疗效，有助于延缓骨骼肌萎缩，促进神经功能恢复；通过刺激神经，可以提高受损神经兴奋性，延缓退变速度[2-5]；推拿手法具有疏通经络、活血化瘀之效，能促进血液循环，提高新陈代谢，进而改善神经肌肉的营养供应[6-9]，促进骨骼肌与神经恢复。本研究探讨推拿手法联合跑台训练对失神经后延期缝合坐骨神经再生的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠60只，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700150167。饲养于上海中医药大学动物实验中心，许可证号SYXK(沪)2014-0008，5只/笼，自由进食饮水，室温18℃，湿度40%～50%。

采用SPSS 19.0统计软件随机分为对照组(n=20)、模型组(n=20)和治疗组(n=20)，每组再分为造模后1个月、2个月2个亚组，每个亚组10只。

1.2 主要试剂及仪器

10%水合氯醛：上海西唐生物科技有限公司。石蜡、甲醛、戊二醛、锇酸、氨水、二甲苯、无水乙醇、30%H2O2：上海国药集团。光谱二抗、DBA浓缩试剂盒、中性树脂、苏木精：上海长岛生物科技有限公司。CX41正置显微镜：OLYMPUS公司。透射电子显微镜及图像分析系统：PHILIPS公司。SQ2125石蜡切片机：MEDITE公司。IMS图像分析系统：基尔顿生物科技(上海)有限公司。D5100数码相机：NIKON公司。自制手法模拟仪：本校与复旦大学共同研制。RM-6240BD多道生理信号处理系统、YLS-15A大鼠转轮式跑步机：成都仪器厂。

1.3 造模方法

采用坐骨神经横断伤立即缝合模型。模型组和治疗组采用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯卧位固定于手术台。右下肢局部剃毛，常规消毒；无菌条件下距坐骨结节下方约0.5 cm处行臀部切口，从股二头肌与半腱肌间显露坐骨神经干，10倍显微镜下钝性分离，于距梨状肌下缘1 cm处切断坐骨神经干，两断端返折180°，但不缝入附近肌组织；缝合肌间筋膜与皮肤。4 d后打开原切口，将断端神经游离并修剪后，外科显微镜下11/0缝合线行外模缝合，对端缝合神经。缝合肌间筋膜与皮肤。术后碘伏消毒，青霉素钠25万U肌肉注射。每天1次，共3 d。

1.4 干预方法

术后3周，模型组和对照组不作任何干预，治疗组进行以下干预。①手法模拟仪模拟捏法行推拿干预，压强6 kPa，捏2 min，间隔1 min。②采用YLS-15A大鼠转轮式跑步机进行训练，5 r/min共5 min。

以上干预均每天1次，于上海中医药大学动物实验中心完成。

1.5 检测指标

各组于干预后1个月、2个月行以下指标检测。

1.5.1 大体观察

观察术后切口情况、肌肉萎缩程度、右下肢活动能力、步态变化及足趾溃疡等。

1.5.2 坐骨神经的运动传导速度(motor conduction velocity,MCV)

采用RM-6240BD四通道生理记录仪，采集频率100 kHz，扫描速度0.8 ms/格，灵敏度4 mV，时间常数0.2 s；频波频率100 Hz，刺激电压1 V，波宽0.1 ms。将刺激电极正负极平行插入坐骨结节下方坐骨神经走行两侧，相距约1 cm；记录电极分别置于腘窝处和跟腱处神经走行两侧；地线位于刺激电极和腘窝处记录电极之间。两对记录电极的距离/动作电位出现的时间差即为坐骨神经MCV。每只大鼠测3次，取平均值。

1.5.3 坐骨神经轴突计数

坐骨神经MCV测定结束后，断颈处死各组大鼠，取出右侧坐骨神经断端下神经组织1 cm，石蜡包埋，切片，HE染色。高倍镜下每标本取5个视野，HPIAS-1000病理图像分析系统记录视野内坐骨神经轴突数。

1.5.4 施万细胞计数

石蜡切片用SP-9003试剂盒(美国ZYMED公司)行S-100免疫组织化学染色。用HPIAS-1000病理图像分析系统400倍镜下每标本取5个视野，计数视野内阳性细胞数。

1.5.5 电镜观察

坐骨神经组织经常规固定、脱水、渗透、包埋，超薄切片，染色，透射电镜观察。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析与处理。计量资料以(xˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 大体观察

手术过程中有2只大鼠因麻醉意外死亡，由备用大鼠补齐；神经修复术后全部动物存活。大鼠手术侧早期出现失神经支配表现，部分足部皮肤发红，少数足趾肿胀；1周左右伤口愈合，伤口无感染。术后1～3周，各组均有大鼠出现不同程度足底溃疡、噬趾，踝关节不同程度僵硬、跖屈受限，坐骨神经支配区出现肌肉萎缩，右下肢跛行。足部溃疡经百多邦外用后明显好转。近1个月时，各组大鼠溃疡基本愈合，术侧肌萎缩明显减轻，跛行步态减轻，踝关节功能活动不同程度恢复。

2.2 坐骨神经MCV

模型组和治疗组MCV均较对照组下降(p＜0.05)，治疗组1个月时MCV与模型组无显著性差异(P＞0.05)，2个月时MCV大于模型组(p＜0.05)。见表1。

表1 两组各时间点坐骨神经MCV比较(m/s)

2.3 坐骨神经轴突计数

模型组和治疗组坐骨神经轴突数均高于对照组(p＜0.05)。坐骨神经轴突数治疗组呈上升趋势，对照组呈下降趋势，但两组间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 两组各时间点坐骨神经轴突数比较(/视野)

2.4 施万细胞计数

模型组和治疗组坐骨神经施万细胞数1个月时均高于对照组(p＜0.05)，2个月时模型组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。治疗组1个月时坐骨神经施万细胞数与模型组无显著性差异(P＞0.05)，2个月时多于模型组(p＜0.05)。见表3。

表3 两组各时间点坐骨神经施万细胞数比较(/视野)

2.5 电镜观察

1个月时，对照组可见有髓神经纤维排列，髓鞘形状正常，间隙适当；模型组见脱髓鞘现象发生，有髓神经纤髓鞘外观不规整；治疗组神经纤维松散，以小型神经纤维多见，髓鞘形态不佳。2个月时，对照组见有髓神经纤维正常排列；模型组有髓神经纤维髓鞘外形呈扁平状，不规整，部分髓鞘出现空泡，有脱髓鞘趋势；治疗组有髓神经纤维总体结构明确，神经纤维结构仍略松散，可见施万细胞。见图1。

3 讨论

本研究显示，推拿手法联合跑台训练能加快坐骨神经损伤失神经后延期缝合大鼠坐骨神经MCV。神经传导速度可反映周围神经功能状态，临床上常用于评价神经损伤程度及功能恢复情况[10-13]。神经损伤后神经传导性受损，表现为神经传导速度减慢或消失。本研究显示，神经损伤修复后，坐骨神经MCV明显减弱；手法及运动训练后，坐骨神经MCV明显恢复。

推拿和运动的作用机制可能通过促进施万细胞增殖，帮助再生神经沿正确的方向生长延伸，进而调节坐骨神经轴突的再生。但手法联合跑台训练促进延期缝合大鼠神经再生的效应需要时间，在1个月时，手法联合跑台训练的优势并不明显，占主导地位的是神经缝合后的自我修复；2个月时，手法联合跑台训练促进坐骨神经再生的优势才得以体现。尽管坐骨神经轴突计数没有显著性差异，但通过电镜观察，可见有髓神经纤维改善情况；结合施万细胞增殖，推测对于有轴突功能的改善仍需进一步时间积累。

本研究MCV恢复，提示神经修复后轴突再生，并有部分到达终末，对靶器官进行再支配。

图1 各组坐骨神经各时间点超微结构(透射电镜,bar=10 μm)

施万细胞是周围神经特有的胶质细胞，最初来源于胚胎时期的神经脊细胞[14]，广泛存在于周围神经系统中，与轴突关系密切，可以包绕轴突，形成髓鞘，进行所谓的有髓神经纤维；也可包绕轴突不形成髓鞘，即无髓神经纤维[15]。周围神经损伤后，施万细胞即刻发生形态行为学改变，最为明显的是沃勒变性。在周围神经损伤再生过程中，施万细胞的功能尤为突出。首先，施万细胞进行自身细胞增殖，为轴突的再生提供通过的管道；其次，施万细胞表达、分泌多种神经再生所需的神经营养因子，促进轴突生长；其三，施万细胞与新生轴突进行包绕，形成有髓、无髓神经纤维，促进轴突成熟；最后，施万细胞能够神经肌肉接头处促进神经再支配。

本研究显示，神经显微修复后，施万细胞数一直稳定保持在较高水平；在此期间，治疗组施万细胞数持续高于对照组，手法及运动训练能促进施万细胞增殖。施万细胞增殖可为新生神经轴浆转运提供良好环境，促进再生轴突沿着正确的方向生长，加速神经轴突直径增大、髓鞘厚度增加，提高坐骨神经MCV。

本研究观察时间最长3个月，而坐骨神经损伤后肢体功能恢复尚需较长时间，目前的结果尚不能全面显示推拿联合跑台训练促进周围神经损伤再生中的作用。周围神经损伤后再生机制复杂，尤其是延期进行神经修复，情况更加复杂。推拿及运动训练促进神经损伤后神经再生及肢体功能恢复的机制仍需进一步研究。

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Effect of Tuina Combined with Treadmill Training on Nerve Regeneration after Sciatic Nerve Delayed Suture in Rats

LU Yong-jia1,YAN Jun-tao1,MA Shu-jie2,TAO Ran2,MA Ying1,SHI Zhi-jun1,KONG Ya-min1,WANG Chun-hong1
1.Department of Tuina,Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai Univesity of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China;2.College of Rehabilitation,Shanghai Univesity of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

YAN Jun-tao.E-mail:doctoryjt@sohu.com

Objective To explore the effect of the combination of Tuina and treadmill training on nerve regeneration after sciatic nerve transection.Methods A total of 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group,model group and treatment group equally.The sciatic nerve was transected in the latter two groups and the epineurium suture was delayed four days.Then the treatment group accepted Tuina and treadmill training once a day.The motor conduction velocity(MCV)of sciatic nerve was measured one and two months after intervention in ten rats respectively,while the number of regenerated axons and Schwann cells was counted,and structures of sciatic never were observed under electron microscopy.Results Compared with the model group,the MCV accelerated in the treatment group(p＜0.05),the number of axons was not significantly different(P＞0.05),and the number of Schwann cells increased two months after modeling(p＜0.05),with less injury under electron microscopy.Conclusion Tuina combined with treadmill training can promote the regeneration of the injured peripheral nerve.

sciatic nerve;nerve regeneration;Tuina;treadmill training;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.007

R745

A

1006-9771(2017)11-1273-05

[本文著录格式] 陆永嘉，严隽陶，马书杰，等.推拿手法联合跑台训练对坐骨神经延期缝合大鼠神经再生的效果[J].中国康复理论与实践,2017,23(11):1273-1277.

CITED AS:Lu YJ,Yan JT,Ma SJ,et al.Effect of Tuina combined with treadmill training on nerve regeneration after sciatic nerve delayed suture in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1273-1277.

1.国家自然科学基金面上项目(No.30973806;No.81373764)；2.国家自然科学基金青年基金项目(No.81603713)。

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院推拿科，上海市200437；2.上海中医药大学康复医学院，上海市201203。作者简介：陆永嘉(1988-)，男，汉族，上海市人，博士研究生，主要研究方向：推拿防治骨骼肌萎缩。通讯作者：严隽陶。E-mail:doctoryjt@sohu.com。

2017-04-17

2017-06-22)