何亚鹏，张 琪，徐丽美，庞文静，付明哲，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR检测方法的建立

何亚鹏，张 琪，徐丽美，庞文静，付明哲，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应，Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法，根据3种病毒的基因组全序列和保守区序列设计 3 对特异性引物，优化反应体系和扩增条件，建立能够同时检测 3 种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明，建立的多重RT-PCR检测方法敏感性强，对FMDV、BTV和PPRV的核酸最低检测量分别为15.42、6.29、16.50 ng/μL；特异性试验结果表明所建立方法的特异性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、快速简便等特点，可以用于临床上 3 种病毒感染的诊断和鉴别。

口蹄疫病毒；蓝舌病病毒；小反刍兽疫病毒；多重RT-PCR

口蹄疫、蓝舌病、小反刍兽疫分别是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的动物急性传染病，这 3 种病毒都可以引起反刍动物发病，且发病率高，并能够形成大范围流行，均被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病[1-3]，在中国被列为一类动物疫病[4]。临床上存在 3 种病毒混合感染，患畜均表现出精神沉郁，体温升高，口腔黏膜、乳头和蹄部冠状带等处发生水泡及溃疡，临床症状极为相似[5-7]。目前对这 3 种疫病的诊断多采用病原分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长，普通PCR检测需要不同的反应体系，耗时费力。因此建立能同时、快速、精确检测并鉴别FMDV、BTV、PPRV 3 种病毒感染的多重RT-PCR方法十分必要。多重PCR技术是在同一PCR体系中加入多对引物同时扩增多种目的基因的分子生物学检测方法，具有快速、灵敏、特异等优点[8]。本研究针对 3 种病毒基因的保守区设计特异性引物，建立特异、敏感、快速并能同时检测鉴别FMDV、BTV和PPRV感染的多重RT-PCR方法，以期为这 3 种病毒感染的同时诊断及鉴别提供方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒与质粒 PPRV疫苗株为新疆天康畜牧生物技术股份有限公司产品；猪瘟兔化弱毒活疫苗(CSFV)为中牧股份有限公司产品；羊口疮疫苗(ORFV)和山羊痘疫苗(GTPV)为齐鲁动物保健品有限公司产品；BTV的RNA、FMDV的RNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和Vero细胞由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2 待检组织或病料 23 份病料是2015年陕西省部分地区养羊场病羊的痂皮、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结等组织样品，每头羊的各种组织混合为 1 份病料。

1.1.3 主要试剂 Fast Quant RT反转录试剂盒和Trizol Reagent试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；Premix rTaqDNA聚合酶为大连宝生物有限公司产品；小量凝胶回收试剂盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit、克隆载体pEASY-T1 Cloning Kit、小量质粒提取试剂盒Easy Pure Plasmid Mini Prep Kit为北京全式金生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI上公布的 3 种病毒的全基因序列并参考国内相关文献[4,9-10]，应用Primer Premier 5.0软件设计 3 对引物，分别用于扩增FMDV的 3D基因、BTV的 NS3基因和PPRV的N基因的保守区。利用NCBI BLAST对引物的特异性进行比对， 3 对引物均具有良好的特异性。引物信息见表1，引物由Invitrogen公司合成。将各引物浓度稀释至20 μmol/L，-20 ℃保存，备用。

表1 PCR引物信息Table 1 The information of primers for PCR

1.2.2 病毒RNA提取及反转录 小反刍兽疫疫苗株RNA的提取按Trizol Regent试剂盒说明进行，所提取的RNA溶于DEPC水中。按照Fast Quant RT Kit试剂盒说明书将 3 种病毒RNA分别反转录为cDNA，反应体系：RNA 2 μg，10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 补至20 μL，反应条件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育 3 min，得到的cDNA于-20 ℃保存，备用。

1.2.3 单项PCR检测 分别以合成的FMDV、BTV、PPRV的cDNA进行单引物单模板PCR扩增。PCR扩增体系为25 μL：Premix rTaqDNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，cDNA 2 μL，去离子水9.5 μL。PCR程序：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。为探索不同退火温度对扩增效果的影响，将退火温度设置51、53、55、57、59 ℃ 5个梯度，以确定单项PCR扩增的最佳退火温度。

1.2.4 多重RT-PCR反应条件的优化 测定FMDV、BTV、PPRV的cDNA质量浓度，统一稀释至50 μg/L，各取1 μL混合后作为多重PCR模板，建立多重PCR反应体系。对多重PCR退火温度(51、53、55、57、59 ℃ 5个梯度)和引物浓度(FMDV、BTV、PPRV上下游各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L 5个梯度)等反应条件进行优化，选择最佳退火温度和引物浓度。

1.2.5 多重RT-PCR特异性试验 采用优化后的反应条件，在反应体系中分别加入 3 种病毒的cDNA和 3 种cDNA混合物作为模板，同时分别加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero细胞的DNA及灭菌双蒸水作为模板，进行多重PCR反应。

1.2.6 多重RT-PCR反应灵敏性检测 测定FMDV、BTV、PPRV的RNA的质量浓度分别为48.2、98.4和51.6 ng/μL。取FMDV、BTV、PPRV的RNA各10 μL进行混合，然后将混合物进行倍比稀释(50～56)，分别将不同稀释倍数的RNA混合物进行反转录，反应体系：RNA混合物 3 μL，10×Fast RT Buffer 3 μL，RT Enzyme Mix 1.5 μL，FQ-RT Primer Mix 3 μL，RNase-Free ddH2O 补至30 μL，反应条件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。得到的cDNA采用优化的扩增条件进行多重RT-PCR扩增，检测多重RT-PCR反应的灵敏性。

1.2.7 重复性试验 应用建立的多重PCR方法，分别对FMDV、BTV、PPRV的cDNA及 3 个cDNA混合阳性样品、CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero细胞的DNA及灭菌双蒸水样品各 2 份重复检测 3 次，以检测所建立方法的重复性。

1.2.8 临床样品检测 利用建立的多重RT-PCR方法对陕西省部分羊场送检的 23 份病羊的痂皮、肝脏、脾脏、淋巴结和肺脏组织样品进行检测，同时采用已经建立的单项RT-PCR方法进行检测，并对结果进行比较[1,9-10]。取疑似病料混合样品约100 mg，加液氮充分研磨后转入组织匀浆器中，加入10 mmol/L PBS(pH 7.2)1 mL充分匀浆。于-80 ℃反复冻融 3 次裂解细胞后，12 000 r/mim离心5 min，上清用于病毒RNA的提取，其余操作按照“1.2.4”已优化的检测方法进行。

2 结果与分析

2.1 单项RT-PCR扩增

通过单项RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳可观察到130 bp(图1-a，FMDV)、257 bp(图1-b，BTV)和687 bp(图1-c，PPRV)的条带，大小与预期相符，证明引物特异性良好，5个退火温度之间差异较小(图1)。

a:FMDV；b:BTV；c:PPRV;M.DNA marker DL2000；1～5.退火温度分别为49、51、53、55和57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃ respectively

图1单项RT-PCR扩增及退火温度优化
Fig.1OptimizationforannealingtemperatureofsingleRT-PCR

2.2 多重RT-PCR引物优化

取不同浓度的引物组合进行多重RT-PCR反应，以获取最佳的引物浓度。结果表明，FMDV、BTV和PPRV引物浓度为0.4 μmol/L时多重PCR扩增效果最好(图2)。

M.DNA marker DL2000；1. FMDV、BTV、PPRV引物终浓度都为0.2 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.2 μmol/L;2. FMDV、BTV、PPRV引物终浓度都为0.4 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.4 μmol/L;3.FMDV、BTV、PPRV引物终浓度都为0.6 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.6 μmol/L;4. FMDV、BTV、PPRV引物终浓度都为0.8 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.8 μmol/L;5. FMDV、BTV、PPRV引物终浓度都为1.0 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 1.0 μmol/L

图2多重RT-PCR引物浓度优化
Fig.2TheprimerconcentrationoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.3 多重RT-PCR退火温度优化

选取不同的退火温度(49～57 ℃)进行多重RT-PCR反应，琼脂糖凝胶电泳结果表明，在53～57 ℃都有较好的扩增效果，试验最终选择55 ℃作为退火温度(图3)。

M.DNA marker DL2000；1～5.退火温度分别为49、51、53、55、57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃, respectively

图3多重RT-PCR退火温度优化
Fig.3TheannealingtemperatureoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.4 特异性扩增

采用优化的PCR反应条件，在反应体系中分别加入FMDV、BTV和PPRV的cDNA及 3 种cDNA混合物作为模板，同时分别加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero细胞的DNA及灭菌双蒸水作为模板，进行多重PCR反应。结果表明， 3 种病毒的cDNA模板以及 3 种cDNA混合物作为模板均能扩增到相对应的目的条带，而其他结果均为阴性，说明此方法特异性好(图4)。

2.5 灵敏性试验

多重RT-PCR灵敏性试验结果表明，在FMDV、BTV和PPRV的引物浓度为0.4 μmol/L时，该多重RT-PCR方法能检测出FMDV、BTV和PPRV的最低RNA质量浓度分别为15.42、6.29、16.50 ng/μL(图5)。

M. DNA marker DL2000；1～10. 多重PCR模板分别为FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO细胞和ddH2O The template of multiplex PCR were FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO cell line and ddH2O

图4多重RT-PCR特异性试验
Fig.4SpecificitytestofthemultiplexRT-PCR

M. DNA marker DL2000；1～7.依次为50～56倍比稀释的病毒RNA Different dilutions of RNA from 50～56

图5多重RT-PCR灵敏性试验
Fig.5SensitivitytestofthemultiplexRT-PCR

2.6 重复性试验

应用建立的多重RT-PCR方法在不同时间对每份样品进行 3 次重复检测。结果表明，检测结果一致，说明该方法重复性良好。

2.7 临床样品检测

应用建立的多重RT-PCR方法对陕西省部分羊场送检的 23 份病羊的痂皮、肝脏、肺脏、脾脏和淋巴结样品进行检测，所有样品检测结果均为阴性，采用已经建立的单项RT-PCR检测所得结果也均为阴性。

3 讨 论

近年来，中国口蹄疫疫情不断发生，给养殖户造成重大损失，再加上周边国家口蹄疫疫情复杂、流行毒株跨境传播的威胁进一步加大中国口蹄疫防控的复杂性和难度[5]。中国云南省(1979)、湖北省(1983)、安徽省(1985)、四川省(1988)、山西省(1993)、广西壮族自治区(1985)等地均报道蓝舌病的爆发。吉林省、辽宁省、新疆维吾尔自治区和西藏自治区也陆续发现蓝舌病的存在[6,11]。小反刍兽疫作为外来病，近期再次在中国部分省份发生和流行，提示必须加强对小反刍兽疫的防控工作[12]。所以，应建立完善的防控体系，及时快速地诊断、净化、隔离，建立免疫缓冲带，这样才能消除国内的疫情和阻止国外疫情向中国蔓延。目前，用于诊断这 3 种疾病的方法主要有病原分离鉴定、ELISA、常规RT-PCR、胶体金免疫试验等。病原的分离鉴定虽然可靠但耗时长且过程繁琐，不宜用于大规模疾病的临床诊断。血清学试验方法是国内主要使用的检测手段，但其存在相对滞后、成本高的缺陷。随着分子生物学技术的发展，PCR方法已经成为众多病原检测和分析的主要手段，但目前还未见能一次性检测和鉴别口蹄疫、蓝舌病、小反刍兽疫的RT-PCR方法的报道。尽快开发出可鉴别这 3 种疫病的快速、特异且敏感的诊断方法，对控制这些具有严重危害的传染病在中国流行具有十分重要的意义。

多重PCR(multiplex PCR)方法具有高效、系统、经济、简便等优点，是在同一个PCR反应体系中加入2对或2对以上的引物，能同时扩增出对应的多个核酸片段的PCR方法。多种病原体在同一反应管内同时被检出将大大节省时间、试剂、经费。该技术主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些遗传病及癌基因的分型鉴定等。本研究针对中国面临的口蹄疫、蓝舌病和小反刍兽疫疫情的严峻形势，建立多重RT-PCR方法，旨在对这 3 种疫病的快速精确诊断、为防控疫情争取有利条件。所建立的多重RT-PCR方法能在同一个反应体系中同时检测出FMDV、BTV和PPRV 3 种病毒的核酸，省时省力。通过对检测方法特异性、敏感性的考察及对样品的检测，初步表明该方法可以应用于口蹄疫、蓝舌病和小反刍兽疫单纯感染和混合感染的检测。

建立一种多重PCR检测方法须经一步步的条件优化才能达到预期的效果。本试验过程中，经过对 FMDV、BTV 和 PPRV 引物浓度和退火温度的优化，各目的片段能够被有效扩增。敏感性试验结果表明，该方法能检测出FMDV、BTV 和 PPRV 的最低 RNA质量浓度分别为15.42、6.29、16.50 ng/μL，敏感性远远高于传统的检测方法，并且已经可以满足临床检测和监测的需要。本试验中目的片段均间隔120 bp以上，扩增结果显示目的条带在琼脂糖凝胶电泳后易于区分且无非特异性扩增出现。应用本研究建立的多重PCR方法对 23 份临床病料进行检测，从检测结果可以看出均未能检出相应病毒核酸，与已建立的单项RT-PCR检测所得结果一致，表明在检测的病料中不存在这些重要的Ⅰ类病原感染，下一步将增加对临床样品检测数量，以进一步丰富检测数据并为流行病学调查提供资料。此外，引起羊发病的还有绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒等DNA病毒以及支原体，所以建立能同时检测羊常见DNA和RNA病毒以及支原体混合感染的多重PCR方法是进一步研究的重点。

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CorrespondingauthorXU Xingang,male,Ph.D,associate professor.Research area:molecular etiology.E-mail: 286567031@qq.com FU Mingzhe, male, senior veterinary officer. Research area: sheep and goat disease. E-mail：1692831800@qq.com

(责任编辑：顾玉兰Responsibleeditor:GUYulan)

EstablishmentofMultiplexRT-PCRMethodforDetectingFMDV,BTVandPPRV

HE Yapeng, ZHANG Qi, XU Limei, PANG Wenjing, FU Mingzhe and XU Xingang

(College of Veterinary Medicine, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to develop multiplex RT-PCR method for the clinical detection of FMDV, BTV and PPRV infection of goats and sheep, three pairs of primers were designed and synthesized according to the highly conserved regions of FMDV, BTV and PPRV genome sequence in GenBank. The multiplex RT-PCR reaction condition was optimized and the multiplex RT-PCR method for detecting FMDV, BTV and PPRV infection was established. The results showed that the newly-established method had high sensitivity. The lowest levels of the three viruses were 15.42 ng/μL,6.29 ng/μL and 16.50 ng/μL, respectively. The specificity test showed that the newly-established method has high specificity. The result indicated multiplex RT-PCR method had specificity, sensitivity, repetitive characteristics and it has applied value in detection of FMDV, BTV and PPRV infection．

FMDV(Foot-and-mouth disease virus); BTV(Bluetongue virus); PPRV(Peste des petits ruminants virus); Multiplex RT-PCR

2016-05-26

2016-06-14

Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2016NY-092); Major Industrial Innovation Chain Projects of Shaanxi Province(No.2016KTZDNY02-06)； Technology Achievement Project of Demonstration Station(Base) of Northwest Aamp;F University(No.TGZX2015-32).

HE Yapeng, male, master student.Research area: molecular etiology and immunology. E-mail:879533817@qq.com

日期：2017-11-17

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.002.html

2016-05-26

2016-06-14

陕西省农业科技创新与攻关(2016NY-092)；陕西省重点产业创新链(2016KTZDNY02-06)；西北农林科技大学试验示范站(基地)科技成果推广(TGZX2015-32)。

何亚鹏，男，硕士研究生，从事分子病原学与免疫学研究。E-mail：879533817@qq.com

许信刚，男，博士，副教授，主要从事分子病原学研究。E-mail：286567031@qq.com 付明哲，男，高级兽医师，主要从事羊病研究。E-mail：1692831800@qq.com

S855.3

A

1004-1389(2017)11-1584-06