吴忠兰,关光玉,尹 婷，赵伟明，曹 愍，杨东智，马学旻

·论 著·

宁夏地区艾滋病患者感染HIV病毒pol区基因变异性研究

吴忠兰1,关光玉1,尹 婷2，赵伟明2，曹 愍1，杨东智1，马学旻1

目的通过巢式聚合酶链式反应检测宁夏地区艾滋病患者感染HIV-1病毒的pol基因片段分析其变异情况，为艾滋病防治提供参考依据。方法采集艾滋病患者全血标本，提取病毒RNA，针对HIV-1病毒pol区设计引物，进行巢式PCR扩增，凝胶电泳鉴定后送测序。结果巢式PCR检测47份,成功扩增35分样本和获得pol区序列，长1 060 bp。宁夏地区HIV-1感染者中存在四种基因亚型，即CRF07-BC占65.7%、CRF08-BC占17.1%、CRF01-AE占11.4%、B亚型占5.7%,基因离散率为B亚型最大。结论HIV-1基因型别趋于多样化，CRF07-BC重组亚型为主要流行毒株，B亚型在宁夏地区流行时间最长；吸毒人群和性活跃人群仍是艾滋病防治的重点人群。

基因序列;进化树;亚型特征

HIV属逆转录病毒科慢病毒属，为逆转录RNA病毒，基因组为两条相同的RNA单链，每条单链9.2～9.8 kb，由结构基因和调节基因组成。其结构基因中的pol基因编码逆转录酶、整合酶和蛋白水解酶，对于HIV病毒的复制、前病毒的整合和增殖都具有重要作用[1-2]。HIV感染类型可以分为1型和2型，中国主要流行HIV-1型，由于HIV-1生存能力弱、抵抗力低，但变异性很强。宁夏在2007年之前是以静脉吸毒传播为主，现以性传播为主。本研究对宁夏地区HIV-1基因亚型展开调查，通过对HIV感染者HIV-1病毒pol区核酸序列进行分析，掌握本地区基因亚型分布情况，为艾滋病的防治提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2015年6-12月，采用方便抽样的方法，在宁夏进行调查。纳入标准为：WB(Western blot)免疫印迹确证阳性、病毒载量gt;1 000 拷贝/mL、年龄gt;18岁。无特殊重大残疾等。共招募调查对象47例，采集感染者5 mL外周血，用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，分离血浆，-70 ℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 实验方法：采用罗氏High Pure Viral RNA Kit试剂盒进行病毒RNA提取，巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HIV-1pol区PR和部分RT基因区。第一轮反应引物序列为MAW-26(5'-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3')和RT-2(5'-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGA-3')，扩增条件分别为50 ℃ 30 min ,94 ℃ 2 min后;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保温。第二轮反应引物为RT-20 (5'-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3')和PRO-1 (5'-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGACCAGAGCCAACAGCCOCA-3'。扩增条件分别为94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 150 s，共30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增产物经凝胶电泳，片段大小约为1.1 kb，鉴定后送北京诺赛基因公司测序。

1.2.2 亚型分析：采用Los Alamos HIV Database 提供的在线工具Quality control和BioEdit软件对所得的序列进行校正和剪裁，采用美国NCBI提供的在线亚型分析工具Genotyping对所获得的序列进行初步分析，采用Mega 6.0软件构建部分毒株的Neighor-Joining 系统进化树(重复运算1 000次)。

2 结果

2.1 基本情况：招募的47例艾滋病感染者，获得35条 pol 序列，其中男性25例，占71.4%；女性10例，占28.6%，呈现四种基因亚型分布。民族以汉族为主，占51.4%；其次为回族，占42.9%。婚姻状况主要为已婚有配偶者，占42.9%，其次为离异或丧偶者，占37.1%；文化程度主要集中在初中和小学及以下低学历组，分别为25.7%和45.7%；亚型中以CRF07_BC为主，其次为CRF08_BC，见表1。

表1 35例基因分型HIV感染者/AIDS患者一般人口学特征和基因分布

2.2 基因亚型分布和重组体：35例HIV-1感染者pol基因区与国际参考株建立系统树分析，确定基因亚型和重组亚型。 结果显示，性传播存在3种重组亚型，静脉吸毒存在4种重组亚型，以CRF07_BC重组亚型为主，为23例(65.7%);其次为CRF08_BC重组亚型6例,CRF01_AE重组亚型4例(18.2%)、B亚型2例(3.0%)，见表2。

表2 35例艾滋病患者基因亚型和传播途径的分布

2.3 不同基因亚型基因离散率的分析：CRF07_BC、CRF08_BC、CRF01_AE和B亚型和国际参考株07_BC.CN.08LNA001、08_BC.CN.97.CNGX6F、01_AE.CF.1990CF402和B.FR83.HXB2比较，计算基因离散率发现，B亚型变异最大，见表3。将23例CRF07_BC重组亚型和国内CRF07_BC重组亚型比较发现，宁夏的CRF07_BC重组亚型形成3个主要的聚集簇，其中NX-35和NX-40与云南的聚集在一起。

表3 宁夏地区HIV-1基因亚型和国际参考株、组内基因离散率比较

3 讨论

据文献报道[3],HIV-1病毒在具有高度亚型多样性的地区,以pol基因分型和用env基因分型的符合率仅86%。不过也有研究表明[4-5],HIV-1的pol基因序列可以用在毒株亚型较为单一的地区作为分型的依据,而且用pol基因分型还可以更好地识别一些重组毒株(CRF)。宁夏属内陆地区，未见有报道HIV基因多样性分布，本次调查两类人群，一类为静脉吸毒人群，另一类为性传播人群，吸毒人群中主要流行CRF07_BC(68.8%)，还存在其他亚型，为B亚型、CRF08_BC和CRF01_AE重组亚型。我国HIV-1分子流行病学调查结果提出，HIV-1基因亚型的流行与传播途径有关，CRF07_BC和CRF08_ BC重组体的流行主要与静脉吸毒有关，CRFO1_AE的流行主要与异性性接触感染有关，B/B’基因亚型主要与供/输血(血制品)有关[6]。本研究 CRF07_BC重组亚型的流行病学资料显示，11例为静脉吸毒人员，这些感染者通过共用注射器感染，因此，在本地区加强美沙酮门诊干预措施显得尤为重要。调查还发现12例CRF07_BC重组体为性传播途径感染，而性传播又是传染病向普通人群传播的有效桥梁,可以推断吸毒和性传播均促进了CRF07_BC重组亚型的持续扩散,本研究结果和上海市吸毒人群HIV基因型分布特征相似[7]。

在我国，CRFO1_AE重组亚型于1994年首次从一名女性性工作者体内检出[8]，主要通过性途径传播。最近的研究结果显示近年来吸毒人群中感染该重组亚型的比例也在逐渐增多[9]，本次报道CRF01_AE重组亚型4例(18.2%)，2例感染者的流行病学资料显示除注射吸毒外，还存在高危性行为，因此混乱的高危行为(静脉吸毒加性行为)容易产生并催化新的重组亚型[10-12]。Holmes等[1,13-14]也曾报道过经异性性传播的HIV与静脉注射吸毒途径、输血途径及同性性传播HIV病毒在进化树中聚集在一起，推测异性性传播途径可能是其他传播途径的“交汇点”。因此，对经异性性传播途径的研究有助于了解HIV-1流行及变异情况。

基因离散率又叫基因距离，反映了基因的变异程度。从宁夏4种不同基因亚型变异程度看，B亚型的变异率最大，其次为CRF01_AE和CRF08_BC重组亚型，通过系统进化树发现，有多对艾滋病感染者的序列差异很小，提示HIV-1在本地区有聚集和加速传播的趋势。根据HIV-1基因变异率每年0.5%～1%计算[15-16]，以pol基因离散率估算，推测HIV-1 B亚型、CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC重组亚型分别在宁夏流行的时间为13～7年、8～6年、6～3年和5～2年。从推测可以看出，尽管CRF07_BC重组亚型在宁夏流行的时间较短，却是此次发现的主要流行株。B亚型在吸毒人群中发现，且流行时间最久，这和宁夏艾滋病流行病学调查结果基本相符[17]。由于本研究涉及的样本为随机抽样，未能系统地反映宁夏地区HIV-1基因亚型的分布情况和特征，仅作为艾滋病基因分布的初探研究。

通过对宁夏地区HIV-1流行株亚型特征的研究显示，宁夏地区HIV-1基因型别趋于多样化，加大了艾滋病防治的难度，须亟待加强对吸毒人群、行活跃人群的宣传教育，普及艾滋病各种防治知识。

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StudyonthegeneticvariationofPolregionofHIVvirusinAIDSpatientsinNingxia

WUZhonglan1,GUANGuangyu1,YINTing2,ZHAOWeiming2,CAOMin1,YANGDongzhi1,MAXuemin1

1.NingxiaCenterforDiseaseControlandPrevention,Yinchuan750004,China；2.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

ObjectiveTo study the characteristics of human immunodeficiency virus (HlV) gene sequence, sub-type distribution and origin of HlV strains, epidemic status and trends in Ningxia, to provide scientific evidence for AIDS prevention and control measures.MethodsAnticoagulating blood samples were collected from HIV infection individuals and epidemiological data were analyzed. Pol gene were amplified by nested PCR from the RNA extraction and then sequenced. The acquired sequences were compared with the international subtype references. The phylogenetic trees were constructed to determine the subtype of the samples.Results47 samples were detected, 35 samples were PCR positive and the sequences were acquired. 23 cases were CRF07_BC (65.7%), 6 cases were CRF08_BC (17.1%), 4cases were CRF01_AE (11.4%) and 2 cases were subtype B (3.0%), and the B subtype were the largest genetic-distance.ConclusionThe subtypes are tending to diversity, CRF07_BC is the dominant strain and shows a high prevalence, drug users and sex active people still are the key of the HIV/AIDS prevention and control of the crowd.

Genesequence;Phylogenetictrees;Subtypecharacteristics

10.13621/j.1001-5949.2017.10.0877

R512

A

宁夏科技攻关计划项目国际合作专项(2013ZYH193)；宁夏自然科学基金项目(NZ13217)

1.宁夏疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004

吴忠兰(1979-)，女， 硕士研究生， 主管检验技师， 从事艾滋病检测工作。

2017-01-03责任编辑李 洁