车瑞波 ，李 芬

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.长沙道勤生物科技有限公司，湖南长沙，410129）

泰万菌素对大鼠结肠菌群的影响

车瑞波1，2，李 芬1

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.长沙道勤生物科技有限公司，湖南长沙，410129）

为研究泰万菌素对大鼠结肠菌群的影响，试验采用PCR-DGGE技术分离方法分析大、小剂量泰万菌素作用下结肠菌群结构的改变情况及其停药后的恢复状态。结果显示，泰万菌素作用时，大鼠结肠内细菌种类稍减少，但大、小剂量组都有4种细菌显著增多；停药后细菌多样性下降，但有较多丰度低的条带出现，结肠菌群结构未受到破坏。

泰万菌素；结肠；DGGE；菌群

消化道微生物与宿主为共生关系，微生物可促进消化道对营养物质的消化吸收，其在消化道内构成的复杂生态环境对宿主的内稳态有重要作用[1]，同时消化道也为微生物提供良好生存环境，两者之间的平衡对维持动物健康起到关键作用。但是，近年来，抗生素滥用问题日益严重，其不仅影响肠道内菌群的种类和数量，破坏肠道菌群结构，还引起细菌产生耐药性。这引起了人们高度重视，同样，在畜牧兽医领域，已发现动物专用抗生素泰乐菌素引起了严重耐药性，为此，人们对其进行了改造，获得了新一代抗生素-泰万菌素。现今，泰万菌素已被用于动物临床对急慢性呼吸道和消化道系统疾病的防治，且已有研究表明泰万菌素可有效治疗猪气喘、猪痢疾、猪增生性肠炎和猪地方流行性肺炎[2]。然而，泰万菌素是否干扰动物消化道菌群结构，目前国内外研究较少。本研究采用PCR-DGGE技术研究泰万菌素作用下大鼠结肠菌群结构的变化及其恢复情况，这对掌握泰万菌素在临床上使用的安全性具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 试验大鼠处理

将18只180 g左右的健康大鼠（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司）随机分成对照组，小剂量组，大剂量组，每组6只，预饲7 d。将11.6 m g、23.2 m g泰万菌素（购自湖南某生物科技股份有限公司）分别溶于50 m L纯净水，分别提供给小剂量组和大剂量组大鼠自由使用，对照组自由饮用纯净水，连续3 d。从第4 d开始，试验组改为纯净水，对照组照常，连续10 d。

试验投喂药物后的第4 d、第11 d分别解剖每组大鼠3只，打开腹腔，无菌条件下剪取结肠1 cm，用无菌生理盐水清洗内容物至无菌1.5 m L离心管里，各组结肠内容物混匀，300 r/m i n离心10 m i n，上清液备用。

1.2 结肠内细菌总DNA提取

以细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）提取上述上清液的细菌总DNA。

1.3 细菌16SrDNAV3区扩增

以通用引物341F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 907R（5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’）扩增制备细菌16SrDNAV2-V4区；反应体系：上述1.2提取的细菌总DNA 2.0 μL，上、游引物各1μL，2×TransTaq H i FiSuperM i x（购自北京全式金生物技术有限公司）25 μL，补加 ddH 2O至50 μL。反应程序：95 ℃ 5 m i n；95 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72.0℃12 s，32个循环；72.0℃ 7 m i n。

以上述扩增产物为模板，341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCGGGG GGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)为引物，扩增制备细菌16S rDNA V3区产物。反应体系和扩增条件同细菌16S rDNA V2-V4区扩增。

取细菌 16S rDNA V3区扩增产物 5 μL，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。

1.4 DGGE电泳

移取上述各组产物5μL于6%的聚丙烯酰胺凝胶点样孔中，以60℃，300 V为电泳条件在变性梯度凝胶电泳仪（购自美国CBS公司，DGGEK-2001）中电泳7 h。EB染色20 m i n，在凝胶成像系统（购自法国Vi l berl ourm at公司，Quant um ST5）下观察拍照，用Quant i t y One v4.6.2软件绘制DGGE电泳图谱。

1.5 DNA回收、克隆、测序

选取DGGE胶中优势条带，标记后无菌条件下切取，ddH2O清洗3次于无菌EP管中，以DNA快速纯化回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）纯化回收。产物与pM ETeasy载体连接，转化DH 5α感受态细胞，构建重组质粒，选择阳性克隆。将产物送至深圳华大基因科技服务有限公司测序。

1.6 序列分析

测序序列与GenBank上已上传序列进行BLAST比对分析，选取相似度最高的同源性序列。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA V3区扩增结果

用上述经两轮扩增后的细菌16S rDNA V3区产物进行电泳，结果如下，细菌16S rDNA V3区片段大小约为200bp，与预期相符。

图1 大鼠结肠内细菌16S rDNA V3区扩增片段

2.2 DGGE电泳结果

用结肠内细菌16S rDNA V3区各组产物进行DGGE电泳，结果见图2。

图2 大鼠结肠细菌菌群DGGE电泳图

2.3 序列比对结果

本实验纯化回收DGGE胶中13条优势条带，克隆测序后，登录GenBankBLAST进行序列比对，得出与之相似度较高的菌种（表1）。

表1 DGGE胶中回收条带序列比对结果

结肠PCR产物经DGGE电泳分离后，不同组得到不同条带数目、不同亮度，不同迁移率条带。从图2可看，实验组相比于对照组菌种数略微下降，如小剂量A10、A12、A15条带消失，大剂量组A5、A9条带消失；但有的细菌数目却急剧增长，呈现高亮状态，如小剂量组A2、A4、A6、A8条带亮度升高，大剂量组A2、A7、A12、A14条带亮度显著增强。

停药后，与实验组相比细菌多样性降低，如小剂量组A1、A2、A4等5条条带消失，大剂量组A2、A7、A10等6条条带消失，但有较多丰度不高的细菌出现。说明在停药后，虽有一些细菌被抑制，但结肠菌群结构未收到破坏，说明泰万菌素在合适的剂量下是安全的。

从表1可见，结肠内细菌与尸毒梭菌（Cl ost ri di um cadaveri s）、毛螺菌（Lachnospi raceaebact eri um）、链霉菌（St rept om yces）、梭菌（Cl ost ri di um）等细菌有较高相似度。有资料表明拟杆菌为机会致病菌，可引起慢性肠炎和直肠癌。大肠杆菌为肠道内共生菌，但大肠杆菌对药物的选择压力很敏感，易产生耐药性[3]。

3 讨论

资料表明，泰万菌素可抑制PRRSV病毒复制[4]，泰乐菌素对支原体有强的敏感性，能抑制革兰氏阳性菌，可控制革兰氏阴性菌如巴氏杆菌等的繁殖，对螺旋体和大病毒也有效[5]。还有研究表明，替米考星和泰乐菌素的治疗作用表现为非抗菌活性的抗炎机制[6]。综上，泰万菌素对结肠菌群结构未产生破坏，且在停药后有一定的恢复趋势，说明泰万菌素可能具备上述作用，且一定程度上是安全的。

虽然泰万菌素没有破坏结肠菌群结构，但是如果长时间大量使用广谱抗生素，其在抑杀有害菌的同时也可对一些肠道有益菌产生抑制作用，可导致肠道菌群多样性降低[7]，故笔者建议不宜长期大量拌喂或混饮泰万菌素。

[1]Dongyao Li,Haiqin Chen,Bingyong Mao,et al.Microbial Biogeography and Core Microbiota of the Rat Digestive Tract[J].Sci Rep.2017,(7):45840.

[2]冯言言,田伟.大环内酯类药物泰万菌素的研究进展[J].广东畜牧兽医科技,2015,40(6):5-6.

[3]贺丹丹,黄良宗,陈孝杰,等.不同动物源大肠杆菌的耐药性调查[J].中国畜牧兽医,2013,(10):211-211.

[4]李桃梅.泰万菌素防控猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外和体内研究[D].上海：上海交通大学,2015:1-2.

[5]赵东峰,任翔,朱丽.泰乐菌素及其衍生物研究进展[J].医药产业资讯，2006，15(3):46-48.

[6]曹兴元,沈建忠,吴聪明,等.替米考星和泰乐菌素对一氧化氮和前列腺素E2合成的抑制作用[C].中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第九次学术讨论会论文与摘要集.安徽合肥：中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第九次学术讨论会.2006:43-49.

[7]姚增武,仲蓓,王东升,等.广谱抗生素对大鼠肠道菌群多样性影响的16S rRNA基因测序研究 [J].齐鲁医学杂志,2014,29(1):32-34.

S859.796

A

1006-4907（2017）05-0043-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.020

车瑞波（1981～），男，湖南长沙人，助理兽医师，主要从事动物疫病的防控和研究，E-mail:158656260@qq.com.

2017-07-18