周方，李 希，*，向采芹，冯建安，黄嫣

Box-Behnken设计优化藿芪温阳丸纯化工艺

周方1，李 希1，2*，向采芹1，冯建安2，黄嫣1

目的：应用Box-Behnken设计-响应面法优化藿芪温阳丸纯化工艺参数条件。方法：以黄芪甲苷含量和除杂率的综合评分为响应值，单因素试验结合Box-Behnken设计对转速，浓缩料液比，离心时间进行考察，优选藿芪温阳丸纯化工艺参数条件。结果：藿芪温阳丸纯化工艺最佳条件为：浓缩料液比为1:3.10，3320 r/min，离心20.15 min。结论：运用Box-Behnken设计-响应面法优化藿芪温阳丸纯化工艺，稳定可行。

黄芪甲苷；除杂率；Box-Behnken；响应面法；纯化工艺

藿芪温阳丸由医生经验方所得，有淫羊藿，黄芪，仙茅，鸡血藤等药味组成，具有温阳益气，活血祛瘀的功效，主治女子痛经、经前期综合症、多囊卵巢综合症，下肢淋巴水肿，男子阳痿遗精等症。

纯化是采用适当的方法和设备除去中药提取液中杂质的操作，一般常用的有水提醇沉法，醇提水沉法，超滤法，澄清剂法，大孔树脂吸附法等[1～2]。因在制剂的生产过程中，离心沉降工艺可作为醇沉的替代方法[3]，故本实验应用离心分离法作为藿芪温阳丸的纯化方法，并应用Box-Behnken设计-响应面法来优选纯化工艺参数。此方法主要通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的关系，从而达到优选工艺参数条件的目的，并且预测性能强[4]。

1 仪器与材料

TG-16S台式微量高速离心机（四川蜀科仪器有限公司）；Agilent-1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；奥泰ELSD800 蒸发光散射检测器；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CS101电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂制造）；电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司）；药材饮片（四川新荷花中药饮片股份有限公司）；黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：974-200106）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制[5]

精密称取黄芪甲苷对照品7.04 mg，置5 ml容量瓶，加甲醇至刻度，定容，摇匀。精密量取2 ml，置5 ml容量瓶中。加甲醇至刻度，摇匀，既得0.5632 g﹒L-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

精密移取提取液适量，加甲醇40 ml超声30min，置蒸发皿中蒸干为粉末，残渣加水10 ml使溶解。水饱和正丁醇提取3次，每次40 ml，合并正丁醇液。氨试液洗涤2次，每次40 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，甲醇定容于5 ml容量瓶即得。

2.3 阴性样品溶液配制

取不含黄芪的提取液，按照2.2项下方法制的阴性样品溶液。

2.4 色谱条件及专属性考察

色谱柱（VP-ODS 150L×4.6 5012145），流动相为乙腈：水（30：70），流速1 ml﹒min-1，漂移管温度：60 ℃，载气压强：2.00 bar,柱温：25 ℃，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000，检测器：ELSD。 取对照品、供试品以及阴性样品溶液各10 μL， 按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图1。表明该方法专属性良好。

2.5 线性范围考察

分别取6组不同浓度的对照品溶液（0.12432，0.24864，0.37296，0.49728，0.6216，1.2432g﹒l-1）各10ul，以对照品峰面积的常用对数值为纵坐标Y，以进样量的常用对数值为横坐标X， 绘制标准曲线。线性回归得到回归方程为：Y＝1.5692X＋4.2459（r＝0.9997）。结果表明黄芪甲苷在1.2432 ug～12.432 ug范围内线性关系良好。

2.6 稳定性试验考察

取上述供试品溶液一份，分别于 0、2、4、8、12、24 h测定黄芪甲苷峰面积，得出供试品中黄芪甲苷平均峰面积积分值为190945，RSD为2.1%，表明该溶液在24 h内稳定。

2.7 单因素试验

以黄芪甲苷含量为指标，单因素试验方法考察转速，浓缩料液比，离心时间对纯化工艺的影响。

2.7.1转速考察 浓缩料液比为1:3，离心时间为20 min，考察不同转速（1000，2000，3000，4000，5000，6000 r/min）对黄芪甲苷含量的影响。随着转速的增加黄芪甲苷含量先增大后趋于平稳，当转速为3000 r/min时，黄芪甲苷含量最大。

2.7.2浓缩料液比考察 离心时间为20 min，转速为3000 r/min，考察不同浓缩料液比（1:1，1:2，1:3，1:4，1:5）对黄芪甲苷含量的影响。随着浓缩料液比的增大黄芪甲苷含量先增大后减小，当浓缩料液比为1:3时，黄芪甲苷含量最大。

2.7.3 离心时间考察 浓缩料液比为1:3，转速为3000 r/min，考察不同离心时间（10，15，20，25，30，35 min）对黄芪甲苷含量的影响。随着离心时间的增加黄芪甲苷含量先增大，后趋于平稳，当离心时间为25 min时，黄芪甲苷含量最大。

2.8 响应面优化实验

2.8.1 响应面实验设计 根据单因素试验结果设计因素水平表（表1），以黄芪甲苷含量和除杂率的综合评分为指标，应用Box-Behnken设计（表2），统计软件Design-Expert.8.05b对试验结果进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程为：Y=87.55+0.30A+1.43B+0.36C+0.92AB-1.03AC-0.088BC-0.93A2-7.31B2-4.71C2(r=0.9839)。说明模型对实际情况拟合较好。方差分析见表3。1330003200.31987.3688.48 1430003200.29098.5686.18 1530002100.22778.3472.47 1615003300.31425.7482.38 1745003100.30286.8883.51

表1 因素水平表

表2 藿芪温阳丸纯化工艺Box－Behnken试验设计

图1 专属性考察（横坐标单位为t/min）

其中综合评分=黄芪甲苷含量/最高值×70＋除杂率/最高值×30。除杂率=提取出膏率（24.26%）－纯化出膏率。出膏率=(M2－M1)V2/mV1×100%。（M1为已恒重的蒸发皿质量，M2为加入提取液后蒸发皿恒重质量，V1为一定量的提取液，V2为待测样品总体积，m为待测样品药材总质量）。

表3 方差分析

由表3可得，此模型P=0.0002＜0.01，表明该模型极显著，可用来响应值预测。矢拟项P=0.2305＞0.05，不显著，说明本实验无其他显著性因素的影响。3个因素对纯化工艺的影响顺序为B＞C＞A，其中B（浓缩料液比）因素P=0.0181＜0.05，表明B因素显著，具有统计学意义。A（转速）因素和C（离心时间）因素对此工艺的影响不是很大。B2和C2（P值均小于0.01）为极显著，具有统计学意义。2.8.2 响应面分析 应用Design-Expert.8.05b软件绘制转速，浓缩料液比，离心时间的响应面3D图，如图2

所示。图中可看出转速在3000-3500 r/min之间，浓缩料液比在1:3左右，离心时间20 min左右时，综合评分的值为最高。最终通过响应面分析及实际应用综合考虑，藿芪温阳丸纯化工艺参数条件为，3320 r/min，浓缩料液比为1:3.10，离心20.15 min。

2.8.3 验证试验 为了验证优化结果的稳定性，应用优选出的参数条件安排3组平行实验。测得黄芪甲苷含量分别为0.3198，0.3146，0.3205 mg/g，平均值为0.3183 mg/g。除杂率分别为7.58%，8.33%，8.01%，平均除杂率为7.97%。综合评分为90.04分，与预测值相比其误差小于3%，说明该模型有较好的预测性，且优化参数条件稳定。

3 讨论

中药复方的纯化工艺在制剂生产过程中有着非常重要的作用，其目的为尽量的溶出方中各药的有效成分或有效部位，最低限度的保留无效甚至有害的杂质，并减少服用量，增加制剂的稳定性，提高疗效等[6]。本研究利用离心法来进行中药复方的纯化，借助离心机高速旋转产生的离心力，使固液达到分离。对于工艺优化应用最普遍的是正交设计，但其数学模型的预测力差，选出条件为已选定水平上的最佳条件，而非最优条件，有一定的局限性[7]。采用Box－Behnken设计-响应面法，建立了一个因素与响应值之间的非线性模型，可准确得到优化最佳工艺条件。应用最终优选出的纯化条件得到黄芪甲苷的含量为0.3183 mg/g，除杂率为7.97%。为后续制剂研发奠定了基础。

图2 响应面3D图

[1] 何春喜,余泽义,何毓敏等. 竹节参总皂苷的大孔吸附树脂纯化与离子交换树脂脱色工艺研究[J]. 中草药,2017,48(06):1146-1152.

[2] 董泰玮,王昌利,史亚军. 复方龙脉宁滴丸中葛根素和薯蓣皂苷纯化工艺研究[J]. 陕西中医,2015,36(02):230-232.

[3] 李同莉,赵国英,袁秀荣,周华,薛金贵. 鹿红方提取纯化工艺研究[J]. 上海中医药杂志,2015,49(11):83-86.

[4] 高宁,张婷婷,张薇等. Plackett-Burman设计和响应面法优化黑果小檗果实总黄酮超声提取工艺[J]. 新疆医科大学学报,2017,40(04):494-49.

[5] 国家药典委员会.中国药典2015年版[S].一部.北京:中国中医药出版社,2015.

[6] 周刚. 中药复方新药研发中工艺研究需关注的问题[J]. 中国新药杂志,2014,23(16):1865-1867.

[7] 兰金荣,叶文斌. 响应面法与正交设计法比较研究天麻多糖提取优化工艺[J]. 包装与食品机械,2014,32(04):10-15.

The optimization of the purification technology of Huoqiwenyang pill using Box-Behnken design

/ZHOU Fang1,LI Xi1,2,XIANG Cai-qin1, FENG Jian-an2, HUANG Yan1//1.( School of Pharmacy, Chengdu university of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. Institute of TCM, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To optimize the purification technology parameters of Huoqiwenyang pill using Box-Behnken design response surface method.Method:The purification technology parameters of Huoqiwenyang pill were optimized with the comprehensive score of Astragaloside content and impurity removal efficiency as response value. The rotational speed,concentration solid-liquid ratio, centrifugal time were investigated by the combination of single factor experiment and the Box-Behnken design.Result:The best purification technology of Huoqiwenyang pill is as following: concentration solid-liquid ratio of 1:3.10, 3320 r﹒min-1, centrifugation for 20.15 min.Conclusion:The purification technology parameters of Huoqiwenyang pill optimized by Box-Behnken design response surface method is feasible and stable .

Astragaloside; impurity removal efficiency; Box-Behnken; response surface method; purification technology

R283.6

A

1674-926X(2017)05-006-04

1成都中医药大学，四川 成都 611137 2四川省中医药科学院中医研究所 四川 成都 610031

周方，女(汉1993-)在读硕士研究生，从事中药新制剂、新技术、新工艺的研究，Tel:18291097486 Email:969708702@qq.com.

*李 希，女(汉1969-)，硕士，教授，从事中药新制剂、新技术、新工艺的研究工作，Tel:13608170046 Email:1836820767@qq.com

2017-4-14

(责任编辑：傅舒)