游燕，牛延菲，张晓南，普冰清，和东阳，刘慧

HPLC测定胆清片中虎杖苷的含量

游燕，牛延菲，张晓南，普冰清，和东阳，刘慧

目的：建立高效液相色谱法测定胆清片中虎杖苷的含量，为该药质量标准提高提供科学依据。方法：色谱柱采用Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相为水-乙腈(80:20)；流速:1.0 mL﹒min-1，柱温:30 ℃；检验波长为306 nm；进样体积10 μL。结果：虎杖苷进样量在0.0047 μg～2.3500 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9998)，平均回收率为98.56%，RSD值为3.43%(n=9)。结论：HPLC法测定虎杖苷的含量简单、准确，具有良好的重复性和稳定性，可作为胆清片中虎杖苷含量测定质量控制方法。

胆清片；虎杖苷；高效液相色谱法

胆清片(糖衣片)为云南白药集团股份有限公司生产，由虎杖、竹叶柴胡、栀子、香附(醋炙)四味中药材加工而成，有清化湿热、疏肝利胆的作用，用于慢性胆囊炎肝胆湿热证。其中虎杖为处方中君药，是蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎及根，性寒、味苦，归肝、胆、肺经[1]，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。虎杖苷是虎杖的特征成分，有较强的抗肝损伤能力，具有保肝利胆和抗菌的作用，主要用于治疗胆石症、胆囊炎、急慢性肝炎等病症[2～6]。

现行标准中胆清片的含量测定是以紫外分光光度法测定大黄素含量，随着药品质量标准的要求提高，建立准确、稳定地测定胆清片中虎杖苷含量的方法就显得非常有必要。本文采用HPLC法对胆清片中虎杖苷进行含量测定以及方法学验证，旨在建立一种准确可行的测定虎杖苷含量分析方法，以期更好地控制产品质量。

1 实验部分

1.1 仪器

美国Agilent高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国安捷伦科技有限公司)；超声波清洗仪(SK3200 LH，上海科导超声仪器有限公司)；电子天平(AG 285型，梅特勒-托利多公司)；纯水机(Advantage A10，Milli-Q)；电热恒温水浴锅(XMTD-4000，北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试药

胆清片，由云南白药集团股份有限公司提供，批号为040210、040728、050315、050824、070330、080425、080811、090108、101116、120109；胆清片缺少虎杖的阴性样品由云南白药集团股份有限公司提供。

虎杖苷对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号：111575-200502，纯度99.9%)；所用流动相水为超纯水，乙腈为色谱纯，处理样品的乙醇为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：水-乙腈(80:20)等度洗脱；柱温：30℃；检验波长：306 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL﹒min-1。理论塔板数按虎杖苷计算不低于4000，在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均能达到基线分离。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含20 μg溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取胆清片10片，去除糖衣，精密称定，研细，精密称取约0.1 g，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。按上述供试品溶液处理方法制备阴性供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

按供试品溶液制备方法制备供试品溶液和缺虎杖的阴性供试品溶液，按上述项色谱条件，分别进样对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液、空白溶液各10 μL。结果见图1，由图谱可以看出供试品溶液色谱中与对照品溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出现，而阴性供试品溶液和空白溶液无此峰出现，表明处方中其他成分对成品中虎杖苷的含量测定无干扰。

图1 虎杖苷HPLC图

2.4 线性关系考察

精密称取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品11.75 mg，置25 mL棕色容量瓶，加稀乙醇制成虎杖苷浓度为0.47 mg﹒mL-1的对照品储备液，再逐级稀释成浓度为235 μg﹒mL-1，94 μg﹒mL-1，47 μg﹒mL-1，23.5 μg﹒mL-1，9.4 μg﹒mL-1，4.7 μg﹒mL-1，2.35 μg﹒mL-1，0.94 μg﹒mL-1，0.47 μg﹒mL-1的系列对照品溶液，按上述项色谱条件测定。以虎杖苷吸收峰面积的积分值为纵坐标Y，进样量(μg)为横坐标X，绘制标准曲线，得回归方程：Y=3854.7X+6.2646，相关系数r=0.9998。结果表明，在上述色谱条件下，虎杖苷在0.0047 μg～2.3500 μg范围内呈良好的线性关系，符合要求。

2.5 回收率试验

精密称取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品12.5 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL各三份，共九份，自然挥干溶剂后，精密加入已知含量(0.59%)同一批号样品约0.05 g，按供试品溶液制备方法制备，将处理好的供试品溶液按含量测定方法测定，结果见表1。试验结果表明，该分析方法回收率在93.66%～101.46%之间，平均回收率为98.56%，RSD值为3.43%(n=9)，回收率良好。

表1 回收率试验结果表

2.6 精密度试验

2.6.1 方法精密度试验 精密吸取虎杖苷对照品溶液(23.5 μg﹒mL-1)，按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，进样量10 μL，记录峰面积，RSD值为0.68%(n=6)，结果表明本法具有良好的方法精密度。

2.6.2 重复性试验 精密称取同一批号样品(批号为：120109)6份，分别按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.2.1”项色谱条件进样，虎杖苷在样品中的平均含量为0.59%，RSD值为1.72%(n=6)，结果表明本法具有良好的重复性。

2.6.3 中间精密度试验 精密称取同一批号样品(批号为：120109)2份，由两位分析人员在不同时间按照“2.2.2”项制备供试品溶液，使用不同高效液相色谱仪，按照“2.1”项色谱条件进样，虎杖苷在样品中的含量为0.58%，RSD值为1.0%(n=4)，结果表明本法具有良好的中间精密度。

2.7 稳定性试验

取同一份样品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0 h、4 h、6 h、12 h、24 h进样，测定峰面积，虎杖苷峰面积RSD值为0.84%(n=5)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 样品测定

取10批样品，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，同时按上述“2.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算样品中虎杖苷的含量，结果见表2。

表2 10批样品虎杖苷测定结果表

3 讨论

3.1 提取溶剂、提取方法选择

根据虎杖的理化性质，本实验参考2015版中国药典一部虎杖项下虎杖苷的前处理(使用稀乙醇作为溶剂进行前处理)，同时结合胆清片的处方工艺(用70%乙醇回流提取)，选择了稀乙醇和70%乙醇进行样品前处理考察。结果表明，用稀乙醇作为提取溶媒，效果最好，故确定以稀乙醇作为提取溶剂。本实验同时比较了超声、回流两种提取方法，结果表明回流提取方式比超声提取方式含量较高，能将虎杖苷完全提取出来，故最终确定回流提取作为样品前处理方法。

3.2 称样范围的考察

本实验选择了不同的称样量进行回流提取，发现称样量在50%-150%范围内含量基本相同，鉴于称样量为0.1 g时供试品溶液的峰面积较合理，故确定称样量为0.1 g。

3.3 限量确定

对10批样品测定结果进行统计分析，本品每片含虎杖以虎杖苷计，剔除测定结果最高值(5.67 mg)及最低值(1.94 mg)，平均值为2.99 mg。按其平均值的70%确定含量限度，建议胆清片每片含虎杖以虎杖苷计为不少于2.0 mg。

4 结论

本文建立了HPLC法测定胆清片中虎杖苷的含量，此方法简便、准确、重现性好、精密度高，阴性无干扰，可作为胆清片中虎杖苷含量测定的方法。该方法为胆清片质量标准提供了可靠依据，可以更好地指导生产，保证药品质量。

[1] 中国国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S](2015版).中国医药出版社,2015;208.

[2] 张海欢,缪红.HPLC法测定疏风解毒胶囊中虎杖苷[J].中成药,2013,35(10):2281.

[3] 富玉海，张立升.HPLC法测定清肝利胆胶囊中虎杖苷的含量[J].中国药师,2007,10(2):147.

[4] 陈 刚.高效液相色谱法测定清肝利胆排石丸中虎杖苷含量[J].中国药业,2015,24(1):46.

[5] 张红,饶俊珍,程璐.高效液相色谱法测定前列回春丸中虎杖苷的含量[J].中国医院用药评价与分析,2015,15(8):1032.

[6] 郝立芳,袁晓芳.HPLC法测定金胆片中龙胆苦苷、虎杖苷含量[J].中国药师,2011,3(9):1369.

Determination of polydatin in Danqing tablet by HPLC

/ YOU Yan, NIU Yan-fei ,ZHANG Xiao-nan, PU Bing-qing, HE Dong-yang, LIU Hui//(Yunnan Bai Yao Group Innovation and Ramp;D Center, Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, kunming 650111, Yunnan)

Objective:To establish a HPLC method for the determination of polydatin in Danqing tablet, and provide scientific basis for improving the quality standard of the drug.Method:Agilent ZORBAX SB C18column (4.6x250 mm, 5 μm) was used. Water-acetonitrile (80:20) was used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL﹒min-1. The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 306 nm and the injection volume was 10 μL.Result:The liner range of polydatin was in the range of 0.0047 μg～2.3500 μg (r=0.9998). The average recovery was 98.56% and the RSD was 3.43% (n=9).Conclusion:The method is simple, accurate with good reproducibility and stability, and can be used as a quality control method for the determination of polydatin in Danqing tablet.

Danqing tablet; polydatin; HPLC

282.6

A

1674-926X(2017)05-007-03

云南白药集团创新研发中心, 云南省药物研究所,云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室, 云南 昆明 650111，云南 昆明 650111

游燕，女，高级工程师，主要从事中药分析 Email:yf_niu@126.com Tel:13577074553

2017-07-21

（责任编辑：李芸霞）