张俊荣 王少为 杨 泽

作者单位：北京医院妇产科，国家老年医学中心，卫生部老年医学重点实验室 100730

肿瘤坏死因子α-308 G>A(rs1800629)多态性与亚洲人群阿尔茨海默氏病发病风险正相关

张俊荣 王少为※杨 泽

作者单位：北京医院妇产科，国家老年医学中心，卫生部老年医学重点实验室 100730

目的发生于阿尔茨海默氏病(AD)的神经炎症可以导致疾病的神经退行性病理改变。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与AD的神经炎症和神经系统的退行性病变的发展相关。肿瘤坏死因子-α的基因多态性(TNFα-308;rs1800629)与AD发生风险的关联已经有报道，但数据来自于不同的人群有巨大的遗传异质性。为发现肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和AD的遗传变异的关系，我们进行了多个种族包括亚洲、南方中国人群，欧洲白人和非裔美国人的meta分析研究。方法我们评估了应用聚合酶链反应(PCR)和限制片段长度多态性(RFLP)技术检测TNFα-308G>A和载脂蛋白(EApoE)的多态性与AD患者的关系。收集MEDLINE，EMBASE和万方数据库发布的最新数据。Mete分析包含了共5443例中国南方人，其中包括AD患者2360例和对照组3083例，采用固定或随机对照分析，评估这种关联强度的比值(ORs)及其95%可信区间(CIs)。结果对13项研究共5443例研究对象的mete分析显示TNFα-308A(rs1800629)与AD没有显著相关性(P>0.05)。然而，根据种族进行分层分析时，mete分析的结果显示，在亚洲人群中(AD患者575例，对照组752例)和AD的相关性显著性增加，分别为等位基因(A/G)：OR=1.75，95%CI=1.34-2.29，P=3.2×10-6;(AG+AA/GG):OR=1.71,95%CI=1.19～2.45,P=0.004;(AA/GG):OR=17.06,95%CI=3.22～90.56,P=0.001。在6项亚洲人群样本中显示，TNFα-308A显著增加了载脂蛋白E?4携带者的AD患者的相关性[(A/G):OR=2.02,95%CI=1.44～2.84,P=4.4×10-6]。结论分析表明，TNFα-308A多态性和AD风险呈正相关在亚洲人群中可能是AD的独立危险因素。

肿瘤坏死因子 阿尔茨海默氏病 mete分析 多态性

目前为止，全球老年痴呆症的患患者数预计高达2400万人，到2040年期间，预计每20年翻一番[1]，对社会是个高昂的负担。阿尔茨海默氏病(AD)是导致老年痴呆症的主要原因，其特征是认知功能进行性下降，最早表现在记忆功能进行性减退[1]。AD患者的神经炎症得到越来越多的关注。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以导致AD患者的神经炎症及神经退行性变的发生，肿瘤坏死因子-α基因编码的多功能促炎性细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族。基因敲除小鼠的研究建议这种基因具有神经保护作用[RefSeq，2008年7月.www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7124]，一些研究表明TNF-α的抑制作用降低了淀粉样病变，防止了神经元丢失，从而提高认知功能[2～4].TNF-α308A等位基因是已知会增加对自身免疫性疾病和炎症疾病，如系统性红斑狼疮、体质过敏症和AD的易感性[5，6]，具有比308G等位基因更高的转录水平[7]。因此，TNF-α的遗传变异可能与AD的发生风险有相关性。自肿瘤坏死因子-α单核苷酸多态性(SNPs)在TNF-α基因中确定以来，开始了SNP 308G>A(rs1800629)的众多研究。然而，不同的研究数据往往是不一致的，在多人群研究中TNFα-308和AD的关系仍然是不确定的。因此，我们进行这些研究，以探索TNFα-308多态性与亚洲、欧洲白人及非洲裔美国人AD风险的mete分析。

1.资料和方法

1.1 研究对象 所有中国参与者招募于广西壮族自治区第三人民医院神经内科的散发AD患者81例(女性48例，男性33例，平均年龄78.9±7.3岁)，健康对照者(158例，女性79例，男性79例，平均年龄70.8±6.9岁)。老年痴呆症的诊断基于DSM-III-R标准，AD的临床诊断基于NINCDS-ADRDA，并排除了血管性痴呆[8]。所有患者均通过计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像(MRI)检测证实。老年痴呆症的行为和心理症状(BPSD)包括：妄想、幻觉、错认、抑郁、类躁狂、激越、无目的漫游/徘徊、躯体和言语性攻击、喊叫、二便失禁及睡眠障碍。健康对照组的入选标准通过充分的病史记录及体格检查的评估。认知功能的评估采用MMSE量表检查。

1.2TNFα-308 A/G and APOE基因多态性基因分型 使用全血基因组DNA提取试剂盒(Biochain，北京科技，中国)提取血液样本中的基因组DNA，使用4个引物进行TNFα-308 A/G多态性检测[9]，分别如下：308A:5’-GGCAATAGGTTTTGAGGGGCTTGA-3’;308G:5’-ACCCTGGAGGCTGAACCCCGCCC-3’;C3:5’-AAGCGGTAGTGGGCCCTGCACTT-3’;C5:5’-GCCCCTCCAGTTCAGTTCTATC-3’，采用PTC225Tetrad?DNA扩增仪在下列条件下进行聚合酶链反应，初始变性96℃3分钟，其后96℃7周期45秒，退火63℃45秒，扩增72℃1分钟，紧接着26个循环的94℃40秒，58℃退火40秒，扩增72℃40秒，72℃7分钟完成。PCR产物的基因被测序检查[10]。

载脂蛋白e基因型检测使用RELP方法，引物：上游F:5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’，下游:5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’。PCR的扩增条件包括初始变性95℃3分钟，其后95℃30秒35个循环，退火64℃30秒，扩增72℃15秒，72℃4分钟。PCR产物由限制性内切酶HhaI消化4小时，37℃，然后通过8%聚丙烯酰胺电泳凝胶和溴化乙锭染色完成，具体方法按Yia-ning Wu等进行[11]。

1.3 Mete分析

1.3.1 文献检索和筛选：我们在PubMed数据库(1965年1月至2014年7月)使用以下关键字进行文献检索，AD，TNF，TNF-α，rs1800629。我们随后在EMBASE数据库(1974年1月至2014年7月)及万方数据库(1990年1月至2014年7月)重复此检索。我们也搜索了参考文献中的原始论文及综述。对于数据库检索不能得到全文的文章，我们手工检索相关期刊和联系作者以获取全文。Mete分析纳入标准：①病例对照研究，②报告结果包括AD的人数或发病率，③全文发表，④多态性应至少为TNFα-308 A/G多态性。排除标准：①没有详细的基因型频率，②数据提取信息不足，③同一患者资源或重复数据。

1.3.2 数据提取：数据收集包括：第一作者姓名、出版年份、原产国、族裔、AD诊断方法、病例及对照组的男女比例及总例数，病例及对照组的平均年龄，以及病例及对照组不同基因型的人数。

1.3.3 统计分析：卡方检验用于测试每个SNP的Hardy-Weinberg平衡，切点为P>0.05。优势比(ORs)及95%可信区间估计为每个风险等位基因与每个非风险等位基因。OR和95%CI在非参数模型[SHEsis(http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)]中进行计算，在AD患者和对照组之间使用卡方检验。统计分析使用SPSS 16.0版软件，P<0.05有统计学意义，使用meta分析2.0软件进行mete分析。首先，比较等位基因用来检测总体差异。其次，应用遗传模型根据种族和ApoEε4多态性进行亚组分析及评估。统计研究之间的异质性及I2统计，分别以25%,50%,75%对应轻、中、重度不一致[12]。当研究中，缺乏异质性，汇总或合并使用固定效应模型[13]。否则，采用随机效应模型[14]

2.结果

2.1 在中国人群中的相关性研究

2.1.1 人群基线数据:我们分析了中国人群包括82例患者(女性：男性为48/33，平均年龄78.9±7.3岁)和158例健康对照(女性：男性为79/79，平均年龄70.8±6.9岁)。TNFα-308基因和ApoE基因多态性的等位基因及基因型频率见表1。每组测试的两个位点的基因频率都很好地符合Hardy-Weinberg平衡。

2.1.2 通过ApoE ε4分层的TNFα-308和AD发病相关性分析：总体来讲，AD患者中ApoE等位基因频率显著高于对照组(χ2=7.880,P=0.019)。AD患者中ApoEε4等位基因携带率也显著高于对照组(χ2=6.189,P=0.015)，如表1所示。我们的研究显示，AD患者和对照组之间通过ApoEε4携带状态分层的TNFα-308A/G相比无显著性差异(P>0.05)。

2.1.3 临床协变量分析：我们的数据显示TNFα-308A/G的基因频率和等位基因与老年痴呆症的程度和临床精神症状没有显著差异。

2.2 多个基于人群数据的mete分析显示TNFα-308与AD的遗传风险相关

2.2.1 研究特点：使用前述的关键词在PubMed,EMBASE及万方数据库进行检索，共发现29篇文章，其中12篇文章可用。13项病例对照研究(2462例AD患者和3085例对照者)关于TNF-308 A/G[9，15～25]，用于评估单核苷酸多态性和AD发病风险的研究。在对照组中，所有的研究中基因分布是相符的。对照组中的受试者没有认知功能障碍，没有老年痴呆症家族史。其中有五项研究在亚洲人群中进行【9,18,19,22,24】，7项在白人中进行[15～17,21,23,25]，1项在非洲美国人中进行[20]。

2.2.2 定量合成:整体的mete分析结果显示TNFα-308A/G和AD的遗传模型之间没有相关性。等位基因A vs.G：OR=0.98,95%CI=0.88～1.11,P=0.788;GA+AAvs.GG：OR=1.02,95%CI=0.88～1.19,P=0.740;GA vs.GG+AA：OR=1.66,95%CI=0.95-2.88,P=0.075;AA vs.GG:OR=1.62,95%CI=0.93～2.84,P=0.087,(见表2)。当根据种族进行分层统计时，我们发现亚洲人种的TNFα-308A/G和AD相关性增加。等位基因A vs.G:OR=1.75,95%CI=1.34～2.29,P=3.2×10-6;GA+AAvs.GG:OR=1.71,95%CI=1.19～2.45,P=0.004;AAvsGG:OR=17.06,95%CI=3.22～90.56,P=0.001。在白种人中，仅等位基因Avs.G的显著性增加OR=0.84,95%CI=0.74～0.96,P=0.012;根据ApoEε4在亚洲人群中进行分层，发现非ApoEε4(Avs.C)的相关性显著增加：OR=2.02,95%CI=1.44～2.84,P=4.4×10-6。因为研究的信息有限，我们无法通过ApoEε4的存在评估其他遗传模型与AD的发病的关联。

2.2.3 敏感性分析和偏移的诊断:进行了敏感性分析，以探讨是否修改纳入mete分析的研究可能影响整体的结果。分析表明，没有单一的研究定性影响总的风险，对TNFα-308等位基因比较的灵敏度分析。然而排除了Sarajarvi等[16]和Mustapic等[15]的两项研究后，在白种人中，等位基因AAvs.GG+GA有显著相关性：OR=1.91,95%CI=1.01～3.61,P=0.047;OR=2.10,95%CI=1.16～3.83,P=0.015。排除这两项研究后，AA与GG比较，也发现了显著相关性：OR=1.90,95%CI=1.00～3.60,P=0.048;OR=2.10,95%CI=1.14～3.77,P=0.017。进行egg测试和漏斗图了解是否有发表性偏倚,结果表明存在发表性偏倚。

3.讨论

在此项研究中，共纳入12篇发表的病例对照研究，汇集了2360例AD患者和3083例对照者总体的mete分析，结果表明TNFα-308的多态性与AD的发病风险无相关性。然而，根据种族进行分层统计时，发现亚洲人种中TNFα-308多态性为AD的发病风险因素。然而，在白种人中得到了相反的结果，TNFα-308多态性是AD的保护性因素。TNFα-308对AD在不同种族人群中发病风险不一致的可能原因如下：①分析研究的数据在分层后是有限的，同时也可能因为偏倚产生假阳性结果。②在亚洲人中，TNFα-308变异与AD的发生具有相关性。种族是最重要的影响因素,有报道种族依赖的遗传因素影响AD的发病风险[26]。ApoEε4是被证实的AD的遗传风险因素之一，对AD的发病有至关重要的作用[27]。通过对ApoE ε4状态的分层研究的mete分析，结果显示亚洲人群中TNFα-308多态性是AD的独立危险因素。一个限制是样本，我们没有能力确定纳入我们的研究有足够大的样本。遗传力的计算常用来评估疾病和遗传多态性之间的关联分析，但没有一项研究报告中纳入研究样本量的计算。样本量不足可能导致TNFα-308 and AD发生改变。

总之，我们的mete分析结果显示TNFα-308是与AD风险相关联的多个种族之间的初步证据,特别是在亚洲人群中，它与AD的发病呈正相关。此外，TNFα-308多态性在亚洲人群中是AD易感性的独立风险因素。因此，期待以TNFα-308多态性、种族及ApoE ε4状态与AD关系开展进一步的流行病学研究。

1 MAYEUX R，STERN Y. Epidemiology of Alzheimer Disease[J]. Cold Spring Harbor Perspectives inMedicine，2012，2(8)： a006239-a006239.

2 GABBITA S P，SRIVASTAVA M K，ESLAMI P，et al. Early intervention with a small molecule inhibitor for tumor nefosis factor-α prevents cognitive deficits in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Journal of Neuroinflammation，2012，9(1).

3 MCALPINE FE，LEE JK，HARMS AS，et al. Inhibition of soluble TNF signaling in a mouse model of Alzheimer’s disease prevents pre-plaque amyloid-associated neuropathology[J]. Neurobiol Dis，2009，34(1)： 163-177.

4 TWEEDIE D，FERGUSON RA，FISHMAN K，et al. Tumor necrosis factor-α synthesis inhibitor 3,6’-dithiothalidomide attenuates markers of inflammation，Alzheimer pathology and behavioral deficits in animal models of neuroinflammation and Alzheimer’s disease[J]. J Neuroinflammation，2012，9： 106.

5 CANDORE G，BALISTRERI CR，COLONNA-ROMANO G，et al. Major histocompatibility complex and sporadic Alzheimer’s disease： a critical reappraisal[J]. Exp Gerontol，2004，39(4)： 645-652.

6 CANDORE G，LIO D，COLONNA ROMANO G，et al. Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype： effect of multiple gene interactions[J]. Autoimmun Rev，2002，1(1-2)： 29-35.

7 WILSON A G. An allelic polymorphism within the human tumor necrosis factor alpha promoter region is strongly associated with HLA A1，B8，and DR3 alleles[J]. Journal of Experimental Medicine，1993，177(2)： 557-560.

8 MCKHANN G，DRACHMAN D，FOLSTEIN M，et al. Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease： report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s Disease[J]. Neurology，1984，34(7)： 939-944.

9 WANG B，ZHOU S，YANG Z，et al. Genetic analysis of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) G-308A and Saitohin Q7R polymorphisms with Alzheimer’s disease[J]. J Neurol Sci，2008，270(1-2)： 148-151.

10 MILICIC A，LINDHEIMER F，LAVAL S，et al. Interethnic studies of TNF polymorphisms confirm the likely presence of a second MHC susceptibility locus in ankylosing spondylitis[J]. Genes Immun，2000，1(7)： 418-422.

11 WU YN，ZHANG JW，ZHANG ZX，et al. An association analysis of apolipoprotein E genotypes with Alzheimer’s disease in Chinese population[J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2001，23(5)： 450-454.

12 HIGGINS JP，THOMPSON SG，DEEKS JJ，et al. Measuring inconsistency in meta-analyses[J]. BMJ，2003，327(7414)： 557-560.

13 MANTEL N，HAENSZEL W. Statistical aspects of the analysis of data from retrospective studies of disease.[J]. National Cancer Institute. Journal，1959(4)： 719-748.

14 DERSIMONIAN R，KACKER R. Random-effects model for meta-analysis of clinical trials： an update[J]. Contemp Clin Trials，2007，28(2)： 105-114.

15 MUSTAPIC M，POPOVIC HADZIJA M，PAVLOVIC M，et al. Alzheimer’s disease and type 2 diabetes： the association study of polymorphisms in tumor necrosis factor-alpha and apolipoprotein E genes[J]. Metab Brain Dis，2012，27(4)： 507-512.

17 ALVAREZ V，MATA IF，GONZáLEZ P，et al. Association between the TNFalpha-308 A/G polymorphism and the onset-age of Alzheimer disease[J]. Am J Med Genet，2002，114(5)： 574-577.

18 YANG L，LU R，JIANG L，et al. Expression and genetic analysis of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) G-308A polymorphism in sporadic Alzheimer’s disease in a Southern China population[J]. Brain Res，2009，1247： 178-181.

19 Jing, L. Shanxi medical university (2006).

20 PERRY RT，COLLINS JS，HARRELL LE，et al. Investigation of association of 13 polymorphisms in eight genes in southeastern African American Alzheimer disease patients as compared to age-matched controls[J]. Am J Med Genet，2001，105(4)： 332-342.

21 TEDDE A，PUTIGNANO AL，NACMIAS B，et al. Lack of association between TNF-alpha polymorphisms and Alzheimer’s disease in an Italian cohort[J]. Neurosci Lett，2008，446(2-3)： 139-142.

22 ZHANG P，YANG Z，WAN CL，et al. Neither the tumor necrosis factor alpha-308 A/G polymorphism nor the alpha2-macroglobulin polymorphism was associated with late-onset Alzheimer’s disease in the Chinese population[J]. Acta genetica Sinica，2004，31(1)： 1-6.

24 ZhangXulai. TNF-α G-308A gene polymorphism of late-onset Alzheimer disease. JOURNAL OF CLINICAL PSYCHOSOMATIC DISEASES，2010，16：485-497 .

25 CULPAN D，MACGOWAN SH，FORD JM，et al. Tumour necrosis factor-alpha gene polymorphisms and Alzheimer’s disease[J]. Neurosci Lett，2003，350(1)： 61-65.

26 WOLLMER MA，KAPAKI E，HERSBERGER M，et al. Ethnicity-dependent genetic association of ABCA2 with sporadic Alzheimer’s disease[J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2006，141B(5)： 534-536.

27 LEONI V. The effect of apolipoprotein E (ApoE) genotype on biomarkers of amyloidogenesis，tau pathology and neurodegeneration in Alzheimer’s disease[J]. Clin Chem Lab Med，2011，49(3)： 375-383.

中国国家自然科学基金(30972709,81061120527,81241082,81370445)，北京医院(BJ-2010-30)

张俊荣，硕士，主治医师，从事妇产科工作。

※通讯作者：王少为，博士，主任医师，从事妇产科工作。

10.3969/j.issn.1672-4860.2017.05.004

2017-8-31