杨延婷，张 丹，吴丽洁，李志元，张 霁，贾一凡，马晓芃，*

(1.上海中医药大学，上海 210203；2.上海市针灸经络研究所，上海 200030；3.北京中医药大学，北京 100001)

东莨菪碱与苯扎氯铵干眼症大鼠造模方法研究

杨延婷1，张 丹2，吴丽洁1，李志元1，张 霁1，贾一凡3，马晓芃1，2*

(1.上海中医药大学，上海 210203；2.上海市针灸经络研究所，上海 200030；3.北京中医药大学，北京 100001)

为比较氢溴酸东莨菪碱皮下注射与苯扎氯铵滴眼制作干眼症动物模型的各自特点，将健康SD大鼠随机分为正常组、东莨菪碱加风组、苯扎氯铵组和吹风对照组。正常组不接受任何处理；东莨菪碱组皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射剂；苯扎氯铵组以2 mg/mL苯扎氯铵滴眼液每日3次滴眼；吹风组仅置于吹风装置中每日12 h。于试验第3、7、10天检查Schirmer I试验(SIT)、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色(FLS)。结果表明，东莨菪碱组在第3、7、10天，SIT与正常组相比具有显著差异(P<0.05)，第7、10天BUT和FLS与正常组相比具有显著差异(P<0.05)；苯扎氯铵组在试验第7、10天，SIT试验和BUT与正常组相比有显著差异(P<0.05)，BUT第10天差异达到最大，在第3、7、10天，FLS与正常组相比具有显著差异(P<0.05)；组织病理学检查东莨菪碱组泪腺较苯扎氯铵组明显有腺上皮细胞萎缩；苯扎氯铵组大鼠角结膜上皮细胞明显变薄，表层细胞排列紊乱，细胞数量显著减少，并存在炎性细胞浸润。提示造模10 d氢溴酸东莨菪碱注射剂皮下注射配合吹风制作的干眼症动物模型对大鼠泪腺及眼表上皮细胞影响显著，伴有较轻程度的眼表损伤，更适合早期轻中度干眼造模；苯扎氯铵滴眼造模方法易造成眼表上皮损伤，适合短期重度干眼的造模。

干眼症；造模方法；东莨菪碱；苯扎氯铵；大鼠

干眼症是由于泪液分泌不足或泪液蒸发过快所引起的泪膜不稳定的疾病。随着现代生活的发展、各种视频仪器的广泛应用、角膜接触镜的佩戴、环境的改变等诸多因素的影响，其发病率逐年升高并趋于低龄化发展，患者生活质量下降并伴有焦虑情绪[1]。越来越多的证据表明，眼表(角膜、结膜和睑板腺)和主泪腺构成的眼表功能单位对泪膜起主要调控作用[2]。干眼症发生时任何泪腺功能单位都有可能受到影响。干眼症的主要发病机制是眼表和主泪腺的炎症，在眼表组织中可以检测到炎症标记物如HLA-DR和白介素(IL) -1β等[3]。

动物试验是干眼研究的重要辅助手段，建立适宜的干眼模型是研究干眼症的前提条件。目前已有多种建立干眼动物模型的方法，如通过环境因素、毒性物质、药物作用、改变动物性激素分泌水平、去除泪腺或眼表的神经支配、诱导泪腺产生自身免疫反应、营养因素及手术摘除泪腺等[4]。现有的干眼动物模型从多方面模拟了干眼的发病机制， 但目前尚无一种模型能够完全反映干眼极其复杂的发病机制以及干眼的慢性、反复发作的病程。在干眼研究中，大鼠作为常用的实验动物，相对于兔模型具有价格便宜，单克隆抗体定购相对容易等优势。因此，探寻大鼠干眼模型的最佳方法显得尤为重要。通过东莨菪碱药物作用抑制泪腺分泌，从而建立泪液生成不足型干眼动物模型及利用防腐剂苯扎氯铵诱导的蒸发过快型干眼症模型是两类应用最为广泛的造模方法[5-6]。本文结合国外相关造模方法研究成果对常用的造模方法及其效应做一对比观察，以期为干眼症基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠20只，体重160 g±20 g，上海中医药大学实验动物中心提供，自由摄食与饮水。裂隙灯显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底无异常的动物方可应用于试验。动物适应性饲养1周后进行试验，随机分为正常组、东莨菪碱吹风组、苯扎氯铵组和吹风对照组，每组各5只。所有动物的操作均符合实验动物伦理委员会的规定。

1.1.2 试剂与仪器 氢溴酸东莨菪碱,上海源叶生物有限责任公司产品；苯扎氯铵,Sigma公司产品；荧光素眼科检测试纸、泪液检测滤纸条，天津晶明新技术发展有限公司产品；9 g/L氯化钠注射液、无水乙醇、甲醛、多聚甲醛、二甲苯、中性树胶粘合剂、十二水合磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾,国药集团化学试剂有限公司产品；苏木素、伊红,南京建成生物科技有限公司产品；裂隙灯显微镜,苏州六六视觉科技股份有限公司产品；光学显微镜及分析软件,Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理 正常组除同一时间检测相关实验室指标并采用抓取固定外，不进行任何处理。东莨菪碱并吹风组(简称东莨菪碱组)采用氢溴酸东莨菪碱皮下注射并置于吹风装置制备大鼠干眼症模型，造模方法参照文献[7-9],方法如下：交替在大鼠双下肢注射0.6 mg/0.1 mL氢溴酸东崀菪碱，每天4次(分别为上午8:00和11:00，下午2:00和5:00)，并将大鼠置于自制的通风装置中，每天连续吹对流风12 h，连续10 d，以完成制备干眼症模型，通风装置按文献[9-10]设计并制作，将大鼠置于两个风扇之间吹自然对流风。苯扎氯铵组造模方法参照文献[5],具体步骤：将50 mg/mL苯扎氯铵溶液配制成2 mg/mL苯扎氯铵滴眼液，每日3次滴眼(分别为上午9:00和12:00，下午3:00)，直至试验结束共10 d。吹风对照组采取抓取并置于通风装置，每天12 h。所有大鼠在同一湿度温度环境下饲养，各组进行相关方法处理后，于第3、7、10天进行泪液分泌量、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色的检测，并进行病理学观察。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 泪液分泌量试验(schirmer test I,SIT) 固定大鼠，采用改良泪液试纸[11](1 mm×15 mm)，置于大鼠下睑外1/3结膜囊内，计时2 min，测量湿长，精确到0.5 mm。重复3次，取平均值。于第3、7、10天进行泪液分泌量检测。

1.2.2.2 泪膜破裂时间观察(break-up time,BUT) 固定大鼠，将荧光素钠检测试纸用1滴生理盐水湿润，试纸尖端轻触大鼠下眼睑内侧并停留片刻，辅触瞬目几次使荧光素分布均匀，裂隙灯钴蓝光下观察角膜出现第一个黑色干燥斑点的时间。重复3次，取平均值。于第3、7、10天进行泪膜破裂时间检测。

1.2.2.3 角膜荧光素染色评分(fluorescein staining，FLS) 固定大鼠，将荧光素钠检测试纸用1滴生理盐水湿润，试纸尖端轻触大鼠下眼睑内侧并停留片刻，辅触瞬目几次使荧光素分布均匀，裂隙灯在钴蓝光下观察角膜荧光染色情况，评价染色分级。评分方法是将角膜分为4个象限，规定无染色为0分，有染色分轻、中、重3级，1分为染色少于5个点，3分为出现块状染色或丝状物，2分介于两者之间，共0～12分。

1.2.3 组织病理学观察 造模结束后戊巴比妥钠麻醉处死后取角膜、结膜和泪腺组织，采用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，采用连续切片，厚度约5 μm。 常规脱蜡至水，然后进行HE染色，常规脱蜡至水；苏木素染色2 min；流水冲洗10 min；盐酸酒精分化5 s；流水冲洗10 min；温水返蓝处理；伊红染色2 min；梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。晾干后在光镜下观察各组大鼠的角膜、结膜和泪腺组织的形态结构变化。

2 结果

2.1 不同造模方法对大鼠泪液分泌量的影响

试验结果显示，与正常组相比，东莨菪碱组和吹风组第3、7、10天泪液分泌量显著降低，苯扎氯铵组第7、10天泪液分泌量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与东莨菪碱组比较，苯扎氯铵组第在第3、7、10天泪液分泌量高，差异有统计学意义(P<0.01)，吹风组第7、10天泪液分泌量高，差异具有统计学意义(P<0.01)(表1)。

2.2 不同造模方法对大鼠泪膜破裂时间的影响

试验结果显示，与正常组相比，东莨菪碱组、苯扎氯铵组第7、10天泪膜破裂时间显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；吹风组与正常组相比，各时间点泪膜破裂时间均无显著性差异(P>0.05)；与东莨菪碱组、苯扎氯铵组相比，吹风组第3、7、10天的泪膜破裂时间较高，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表1 不同干眼造模方法大鼠泪液分泌量的变化Table 1 Comparison of the tear secretion volume of dry eye rats by different molding methods

注：与正常组比较，aP<0.01；与东莨菪碱组比较，bP<0.01。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01.

表2 不同干眼造模方法大鼠泪膜破裂时间的变化Table 2 Comparison of the BUT of dry eye rats by different molding methods

注：与正常组比较，aP<0.01；与东莨菪碱组比较，bP<0.01;与苯扎氯铵组比较，cP<0.05。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01;Compared with benzalkonium group，cP<0.05.

2.3 不同造模方法对大鼠角膜荧光素染色的影响

试验结果显示，与正常组相比，东莨菪碱组第7、10天角膜荧光素染色评分显著增高，苯扎氯铵组第3、7、10天角膜荧光素染色评分显著增高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而吹风组第3、7、10天，角膜荧光素染色评分与正常组比较均无显著性差异。与东莨菪碱组比较，苯扎氯铵组第7、10天染色评分显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与苯扎氯铵组相比，吹风组第3、7、10天荧光素染色评分较低，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

2.4 不同造模方法对大鼠眼表组织损伤的影响

2.4.1 不同造模方法对大鼠角膜组织的影响 镜下观察，正常组大鼠角膜呈现典型五层结构，即由内而外依次为内皮细胞层、后弹力层、基质层、前弹力层、上皮细胞层，各层结构完整，分布清晰，上皮层主要为5～6层细胞构成，主要为扁平细胞、翼状细胞、基底细胞，上皮细胞极性存在，排列整齐，数量正常，分布均匀。与正常组比较，东莨菪碱大鼠角膜上皮层显著变薄，细胞排列紊乱，上皮细胞角化层明显变厚，细胞肿胀明显，体积显著增大，基质层较疏松，可见少量成纤维细胞堆积肉芽组织增生及新生毛细血管。苯扎氯铵组大鼠角膜明显变薄，表层细胞排列紊乱，细胞数量明显减少，表面细胞不完全角化，核间距增大，部分区域染色变浅细胞水肿明显，有大量炎细胞浸润和新生血管，可见少量嗜酸性粒细胞，基质层明显疏松。吹风组可见上皮细胞少量减少，表皮层轻微角化，基质层疏松。结果表明东莨菪碱及苯扎氯铵造模方法能不同程度的损伤大鼠角膜组织结构，苯扎氯胺组对角膜的损伤程度更严重(图1)。

表3 不同干眼造模方法对大鼠荧光素染色评分的影响Table 3 Comparison of the corneal fluorescein staining score of dry eye rats by different molding methods

注：与正常组比较，aP<0.01；与东莨菪碱组比较，bP<0.01;与苯扎氯铵组比较，cP<0.05。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01;Compared with benzalkonium group，cP<0.05.

A1.正常组(200×);A2.正常组(400×);B1.东莨菪碱组(200×);B2.东莨菪碱组(400×);C1.苯扎氯铵组(200×);C2.苯扎氯铵组(400×);D1.吹风组(200×);D2.吹风组(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
图1各组大鼠角膜组织HE染色
Fig.1 HE staining of rat cornea tissues in each intervention group

2.4.2 不同造模方法对大鼠结膜组织的影响 光镜下可见，正常组大鼠结膜结构完整，主要由表层及固有层组成，表层为复层柱状上皮细胞，光滑完整，细胞表面有微绒毛，胞核层叠呈柱状，上皮细胞间散在杯状细胞，体积偏大，胞内富含黏液颗粒，固有层为结缔组织，含有大量胶原纤维、成纤维细胞、血管、神经等。与正常组相比，东莨菪碱模型组大鼠结膜上皮表层明显变薄，细胞排列紊乱，结构欠完整，少量细胞呈半脱落状，杯状细胞数量减少，伴轻度水肿，有少量炎性细胞浸润。苯扎氯铵组大鼠结膜上皮表层变薄，杯状细胞结构不完整，局部出现缺损，有炎症细胞浸润，间质间血管扩张、充血，并可见大面积水肿，细胞数量明显减少。吹风组上皮细胞数量减少，杯状细胞排列较规则(图2)。

A1.正常组(200×);A2.正常组(400×);B1.东莨菪碱组(200×);B2.东莨菪碱组(400×);C1.苯扎氯铵组(200×);C2.苯扎氯铵组(400×);D1.吹风组(200×);D2.吹风组(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
图2各组大鼠结膜组织HE染色
Fig.2 HE staining of rat conjunctiva tissues in each intervention group

2.4.3 不同造模方法对大鼠泪腺组织的影响 光镜下观察，正常组大鼠泪腺组织由大小不等的小叶组成，小叶间主要成分为致密结缔组织，含成纤维细胞及大量胶原纤维，散在淋巴细胞、血管、神经等，腺泡大小均匀，排列紧密，腺上皮细胞结构完整并呈高柱状，细胞核位于基底部，胞浆内富含分泌泡，腺泡腔内可见泡状黏液。与正常组比较，东莨菪碱模型组泪腺上皮细胞萎缩，体积变小，腺腔扩大，排列欠规则，结构不清晰，腔内黏液物质明显减少，小叶间隙增大，结缔组织明显水肿。苯扎氯铵组泪腺上皮轻微萎缩，间隙增大，黏液物质少量减少。吹风组腺泡大小较均匀，排列紧密，腺上皮细胞结构完整(图3)。

A1.正常组(200×);A2.正常组(400×);B1.东莨菪碱组(200×);B2.东莨菪碱组(400×);C1.苯扎氯铵组(200×);C2.苯扎氯铵组(400×);D1.吹风组(200×);D2.吹风组(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
图3各组大鼠泪腺组织HE染色
Fig.3 HE staining of rat lacrimal gland tissues in each intervention group

3 讨论

寻找适宜的干眼症动物模型对于阐述干眼症发病机制及评估有治疗前景的药物或干预方法是至关重要的，在过去十年的发展中各种动物模型已经研究出来用于模仿不同病理生理机制的干眼症[7,12-14]。然而，并没有一个可以精确地模拟临床表现和人类干眼病的发病机制的模型。本研究对照研究了东莨菪碱配合吹风与苯扎氯铵造模方法对大鼠眼表功能和病理学影响，以期为选择适宜的干眼症造模方法提供参考数据。

SIT和BUT结果显示0.6 mg/0.1 mL的东莨菪碱皮下注射结合吹风在短期内可以较好的模拟人类干眼症。Sabrina Viau等[15]分别采用6、 12.5、25 mg/d的东莨菪碱剂量皮下注射连续观察28 d发现都引起了不同程度的角膜炎，第10天时结膜上皮细胞及泪腺中MHC-Ⅱ蛋白、TNF-α、 IL-1β 及 IL-6 mRNA表达均升高，而这些促炎因子已经被证实在泪液蒸发过快和生成不足型干眼症模型中被诱导产生[16-17]。Yusha Ru等[6]给小鼠局部皮下注射东莨菪碱抑制鼠泪液的产生。同时将这些鼠放置在一鼓风装置制造的干燥环境中，发现可以较快地产生干眼模型。氢溴酸东莨菪碱是一种外周作用较强的抗胆碱药，可作为一种副交感神经抑制剂，东莨菪碱能够抑制中枢神经系统，并产生与阿托品相似的药理作用，如瞳孔放大、神经麻痹和抑制腺体分泌。在干眼造模研究中其作用是阻断泪腺的胆碱能受体从而减少泪液的分泌。设置通风对流装置所产生的持续快速气流可以破坏泪膜的稳定性，从而加快泪液蒸发。本研究发现，在使用东莨菪碱配合吹风后泪膜稳定性下降，并伴有角膜上皮的点状缺失，病理观察提示角、结膜表面有不同程度的损伤，并伴有炎症浸润，这种改变也较符合早期轻中度干眼。此外本研究还发现如果单用持续气流，对眼表功能及泪膜的稳定也会有一定影响，这个结果与Yoon K C等[18]的研究结论相符合。此外，大鼠在持续吹风环境中，眼表很容易被吹起的垫料木屑渣进入并引起损伤，也与多次检测眼表相关指标而对大鼠眼表造成一定的人为刺激损伤有关。

苯扎氯铵是多种滴眼液中常用的防腐剂，也是临床上引起干眼症不适症状的常见因素。Lin Z等[5]研究利用苯扎氯铵诱导小鼠干眼模型，7 d后验证模型成功。该方法不仅临床表现类似于人类干眼，且相关组织病理改变也与人类干眼相近，包括泪膜稳定性受损、眼表炎症、角膜上皮细胞凋亡与杯状细胞的丢失、鳞状上皮化生等。而近年来常以该方法作为严重型干眼造模方法之一，基于其防腐剂的性质，苯扎氯铵诱导的干眼模型归类为蒸发过快型干眼，有其独特的特点和局限性。本研究结果显示，苯扎氯铵组大鼠角膜荧光素染色评分较其他组显著升高，病理染色结果证实该造模方法对大鼠眼表有严重的损伤作用，适用于短期重度干眼的造模。由于广泛的可用抗体和不同转基因品种的易得性，大鼠模型为常用的一类用于泪腺和眼表相关炎症免疫机制研究的动物。但是在造模的过程中存在许多的不确定因素，值得研究者深度思考和改进。由于炎症在干眼症中扮演着重要作用，本研究中东莨菪碱加吹风和苯扎氯铵这两种造模方法均可以用于干眼症相关炎症机制的研究，并可能运用于作为评估抗炎药物和方法的治疗效果。

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StudyonDryEyeModelingbyScopolamineandBenzalkoniumChlorideinRats

YANG Yan-ting1,ZHANG Dan2,WU Li-jie1,LI Zhi-yuan1,ZHANG Ji1,JIA Yi-fan3,MA Xiao-peng2

(1.ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,201203,China;2.ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,Shanghai,200030,China;3.BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing,100001,China)

To compare the dry eye models developed by subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide and eye drops of benzalkonium chloride in rats respectively,healthy SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group(NG),scopolamine plus blowing group(SG),benzalkonium group (BZG) and blowing group (BG),5 rats in each group.The rats in the NG didn't receive any treatment,while rats in SG were administered alternatively into the lower limbs with 0.5 mL scopolamine hydrobromide (0.6 mg/0.1 mL) ( 4 times a day ),the rats in the BZG were given with eye drops of benzalkonium chloride ( 2 mg/mL ) three times a day,and the rats in the BG were kept in the blowing device for 12 h everyday.Then,Schirmer Ⅰ test (SⅠT),tear membrane breakup time (BUT) and fluorescein staining (FLS) were tested in each group.After experiment,the inter-group comparison of SⅠT in SG and NG showed statistically significance on day 3,7 and 10 (P<0.05),and the comparison of BUT and FLS showed statistically significance on day 7 and 10 (P<0.05).For rats in BZG,the inter-group comparison of SIT and BUT with NG showed statistically significance on day 7 and 10 (P<0.05),the most substantial changes of BUT appeared at day 10,and the comparison of FLS with NG showed statistical significance (P<0.05).Histopathological examination of lacrimal gland showed a more obvious atrophy of glandular epithelial cells in SG when compared with that in BZG;Rats in BZG showed a thinner corneal surface,chaotic cell arrangement,a reduction of the cell number and infiltration of inflammatory cells which indicated that at day 10,the subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide combined with blowing method had obvious influence on lacrimal gland and ocular epithelium cells in rats with an ocular surface damage in a mild degree which is suitable for creating mild to moderate dry eye model in early stage,while eye drops of benzalkonium method can cause damage to ocular surface more easily which is more suitable for creating severe dry eye in a short period.

dry eye;modeling method;scopolamine;benzalkonium chloride;rat

2017-01-16

上海市卫生和计划生育委员会项目(№201440412，ZJ2016028)；上海市自然科学基金项目(№13ZR1439500)

杨延婷(1990-)，女，甘肃兰州人，博士研究生，主要从事针灸免疫学研究。*

Q789

A

1007-5038(2017)10-0043-08