崔志勇

(郑州大学体育学院，河南郑州 450044)

有氧运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡及相关基因蛋白表达的影响

崔志勇

(郑州大学体育学院，河南郑州 450044)

探讨有氧运动对兔骨关节炎软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达的影响。建立兔骨关节炎(OA)模型，试验分为空白对照组、模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组。TUNEL标记法检测不同强度有氧运动对关节炎软骨细胞凋亡的影响；Western blot检测Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达。模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著高于空白对照组，低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著低于模型对照组，中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率显著低于低强度运动组(P<0.01)； 模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著高于空白对照组，Bax蛋白表达显著低于空白对照组；低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著低于模型组对照组，Bax蛋白表达显著高于模型对照组；中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著低于低强度运动组，Bax蛋白表达显著高于低强度运动组(P<0.01)。不同强度有氧通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达降低关节炎软骨细胞凋亡，并下调MMP-2、MMP-13，降低软骨细胞的损伤，其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

兔；关节炎软骨细胞；凋亡；人基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶13；Wnt同源基因/β连环蛋白信号通路

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是常见的一种慢性退行性疾病，其病理特征是关节软骨的变性、退化及骨质增生，发病率与年龄呈正相关[1]。目前对OA治疗主要采用运动疗法、物理治疗、关节腔内注射药物等保守治疗[2]。运动疗法因效果好，且治疗方便，已在临床应用中受到广泛关注。

研究显示，运动能降低体内炎性因子水平，促进关节软骨损伤修复[3]。Wnt/β-catenin信号通路能调节关节软骨细胞的增殖、凋亡、分化[4-5]，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2和13是两种基质金属蛋白酶，MMP-2表达上调对软骨基质具有破坏作用，MMP-13表达上调能损坏骨架结构[6-7]。运动可调节MMP-2和MMP-13表达[8]，但具体的运动强度及其调节机制仍不明确。本研究旨在证实低强度和中等强度有氧运动对关节炎软骨细胞凋亡及MMP-2和MMP-13表达的影响，且是否与Wnt/β-catenin信号通路调节有关，以期为后续治疗骨关节炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 36只6周龄新西兰大白兔，郑州大学动物医学实验室提供，体重为2.36 kg左右。

1.1.2 试剂和仪器 戊巴比妥，Sigma公司产品；Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13抗体及辣根过氧化物标记的二抗，美国Abcam公司产品；β-catenin、GSK-3β抗体，北京博奥森生物技术有限公司产品；BCA试剂盒，碧云天生物技术有限公司产品；垂直电泳槽DYCZ-24EN,北京六一仪器厂产品；石蜡切片机，LEICA RM2126公司产品。

1.2 方法

1.2.1 骨关节炎(OA)模型建立 所有动物笼内适应性饲养1周后，除空白对照组外的兔用30 g/L戊巴比妥(1.5 mL/kg)耳缘注射麻醉，将兔仰面固定于手术台上，左后膝关节剪毛消毒，向膝关节中注射0.2 mL 40 g/L的木瓜蛋白酶，每3天注射1次，从第1次注射算起，2周后建模成功(随机选择2只试验兔，进行膝关节MRI检测，验证造模成功)。

1.2.2 试验分组及运动干预方案 试验分为4组：空白对照组、模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组。空白对照组6只，其他3组各8只。采取跑台有氧运动训练，参照Bedford等提供的运动负荷标准，低强度运动组运动速度为0.5 km/h，每次20 min，每周3次；中等强度运动组运动速度为1.5 km/h，每次20 min，每周5次。

1.2.3 不同强度运动对兔关节炎软骨细胞凋亡的影响 按照细胞凋亡试剂盒说明进行左后肢股骨内踝关节面软骨石蜡切片，DAB显色后进行苏木素复染，切片中软骨细胞核中出现黄色颗粒者为TUNEL阳性，即细胞凋亡。每张切片观察10个视野，以平均100个细胞核中含有的凋亡细胞数作为凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 不同强度运动对关节炎兔软骨细胞Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β蛋白表达的影响 向左后肢股骨内踝关节面软骨中加入适量的预冷蛋白抽提试剂匀浆，4℃、14 000 r/min离心15 min，收集上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与Loading buffer充分混合后，100℃煮沸5 min。SDS-PAGE电泳分离，4℃转膜过夜。取出PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉封闭。Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-13、β-catenin、GSK-3β作为一抗(500倍稀释)，4℃过夜。室温复温30 min，TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 000稀释)反应50 min，TBST洗膜，ECL发光，以GAPDH为内参计算蛋白表达率。

2 结果

2.1 不同强度有氧运动对关节炎软骨细胞凋亡的影响

模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著高于空白对照组，低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率均显著低于模型组对照组，中等强度运动组关节炎软骨细胞凋亡率显著低于低强度运动组(图1)(P<0.01)。提示有氧运动能降低关节炎软骨细胞凋亡，且中等强度运动效果优于低强度运动。

2.2 不同强度有氧运动对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2蛋白表达均显著高于空白对照组，Bax蛋白表达显著低于空白对照组；低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2蛋白表达显著低于模型对照组，Bax蛋白表达显著高于模型对照组；中等强度运动组关节炎软骨细胞Bcl-2蛋白表达显著低于低强度运动组，Bax蛋白表达显著高于低强度运动组(图2)(P<0.01)。

2.3 不同强度有氧运动对MMP-2、MMP-13蛋白表达的影响

模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞MMP-2、MMP-13蛋白表达均显著高于空白对照组，低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞MMP-2、MMP-13蛋白表达均显著低于模型对照组，中等强度运动组关节炎软骨细胞MMP-2、MMP-13蛋白表达显著低于低强度运动组(图3)(P<0.01)。

1.空白对照组；2.模型组对照组；3.低强度运动组；4.中等强度运动组
与空白对照组比较，aP<0.01;与模型组对照组比较，bP<0.01；与低强度运动组比较，cP<0.01
1.Control group;2.Model control group;3.Low intensity exercise group;4.Moderate intensity exercise group
Compared with the blank control groupaP<0.01;Compared with the model control group,bP<0.01;Compared with the low intensity exercise group,cP<0.01
图1不同强度有氧运动对关节炎软骨细胞凋亡的影响
Fig.1 Effect of aerobic exercise at different intensities on the apoptosis of articular cartilage cells

2.4 不同强度有氧运动对β-catenin和GSK-3β蛋白表达的影响

模型对照组、低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著高于空白对照组，低强度运动组、中等强度运动组关节炎软骨细胞β-catenin、GSK-3β蛋白表达均显著低于模型组对照组，中等强度运动组关节炎软骨细胞β-catenin、GSK-3β蛋白表达显著低于低强度运动组(图4)(P<0.01)。

3 讨论

细胞凋亡是细胞内特定基因程序性表达介导的细胞死亡，随着分子生物学研究的不断深入，发现在骨关节发病机制中调节细胞凋亡具有重要意义[9-10]。研究表明，软骨细胞凋亡是引起骨关节炎软骨降解的重要因素[11]。软骨细胞凋亡受到多种途径的调节作用，包括线粒体途径、内质网应激反应性凋亡途径等，线粒体通透性改变是线粒体途径引起细胞凋亡的关键步骤[12-13]。Bcl-2蛋白家族对PT孔的开放和关闭具有调节作用[14]，通常以Bcl-2/Bax形成的二聚体的形式发挥作用。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的抑凋亡蛋白，Bax是Bcl-2蛋白家族的促凋亡基因，Bcl-2/Bax比值升高，抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡[15-16]。在关节炎患者中，Bcl-2表达升高，Bax表达降低，而通过运动后，Bcl-2表达较未运动组降低，Bax表达较未运动组升高[17]，这说明运动可通过降低Bcl-2/Bax比率抑制关节炎软骨细胞凋亡。本研究结果显示，低强度和中等强度有氧运动均可降低关节炎软骨细胞凋亡，并使Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，且中等强度运动效果优于低强度运动。这说明不同强度有氧运动可通过调节Bcl-2/Bax比率抑制关节炎软骨细胞凋亡。

A.Western blot；B.蛋白表达率；1.空白对照组；2.模型组对照组；3.低强度运动组；4.中等强度运动组
与空白对照组比较，aP<0.01;与模型组对照组比较，bP<0.01；与低强度运动组比较，cP<0.01
A.Western blot;B.Protein expression rate;1.Control group;2.Model control group;3.Low intensity exercise group;4.Moderate intensity exercise group
Compared with the blank control groupaP<0.01;Compared with the model control group,bP<0.01;Compared with the low intensity exercise group,cP<0.01
图2不同强度有氧运动对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
Fig.2 Effect of aerobic exercise at different intensities on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins

A.Western blot；B.蛋白表达率；1.空白对照组；2.模型组对照组；3.低强度运动组；4.中等强度运动组
与空白对照组比较，aP<0.01;与模型组对照组比较，bP<0.01；与低强度运动组比较，cP<0.01
A.Western blot;B.Protein expression rate;1.Control group;2.Model control group;3.Low intensity exercise group;4.Moderate intensity exercise group
Compared with the blank control groupaP<0.01;Compared with the model control group,bP<0.01;Compared with the low intensity exercise group,cP<0.01
图3不同强度有氧运动对MMP-2和MMP-13蛋白表达的影响
Fig.3 Effect of aerobic exercise at different intensities on the expressions of MMP-2 and MMP-13 proteins

A.Western blot；B.蛋白表达率；1.空白对照组；2.模型组对照组；3.低强度运动组；4.中等强度运动组
与空白对照组比较，aP<0.01;与模型组对照组比较，bP<0.01；与低强度运动组比较，cP<0.01
A.Western blot;B.Protein expression rate;1.Control group;2.Model control group;3.Low intensity exercise group;4.Moderate intensity exercise group
Compared with the blank control groupaP<0.01;Compared with the model control group,bP<0.01;Compared with the low intensity exercise group,cP<0.01
图4不同强度有氧运动对β-catenin和GSK-3β蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of aerobic exercise at different intensities on the expressions of β-catenin and GSK-3β proteins

MMPs是广泛存在于各种结蹄组织中的蛋白水解酶家族，其异常表达可引起胶原骨架断裂及蛋白多糖降解，从而导致软骨变性破坏，因此对OA的病理进程有重要作用[18-19]。根据作用底物不同可分为胶原酶、明胶酶、基质溶解酶、膜酶和多相亚群。MMP-13是一种胶原酶，在MMPs家族中作用底物最广，对Ⅱ型胶原酶降解能力很强，能直接使软骨基质的胶原骨架降解，是OA基质降解的关键酶[20]。MMP-2是一种明胶酶，可将已变性的Ⅱ型胶原再次降解，导致软骨基质破坏[21]。研究显示，运动可下调MMP-13和MMP-2表达[22]。本研究结果显示，低强度和中等强度有氧运动均能降低MMP-13和MMP-2表达。这说明不同强度有氧运动可通过下调MMP-13和MMP-2降低软骨细胞的损伤。

Wnt/β-catenin信号通路被称为Wnt正规通路，由跨膜受体、β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt、GSK-3β等组成[23]。Wnt/β-catenin信号通路对关节软骨细胞的增殖、凋亡、分化、成熟等过程有调节作用，并参与了软骨外基质的分解代谢，对病理过程有重要影响[24]。因此，有研究者认为Wnt/β-catenin信号通路可能在软骨的破坏过程中起作用[24-25]。本研究为了证实运动是否调节Wnt/β-catenin信号通路，通过Western blot检测β-catenin和GSK-3β蛋白表达，结果显示，低强度和中等强度有氧运动均能下调β-catenin和GSK-3β蛋白表达。这说明不同强度的有氧运动通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制关节炎软骨细胞凋亡，并通过调节MMP-13和MMP-2表达降低软骨细胞的损伤。

综上所述，不同强度有氧通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达降低关节炎软骨细胞凋亡，并下调MMP-2、MMP-13蛋白表达降低软骨细胞的损伤，其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

[1] van Walsem A,Pandhi S,Nixon R M,et al.Relative benefit-risk comparing diclofenac to other traditional non-steroidal anti-inflammatory drugs and cyclooxygenase-2 inhibitors in patients with osteoarthritis or rheumatoid arthritis:a network meta-analysis[J].Rheumatol Int,2015,17(1):66.

[2] Tsai P H,Lee H S,Siow T Y,et al.Abnormal perfusion in patellofemoral subchondral bone marrow in the rat anterior cruciate ligament transection model of post-traumatic osteoarthritis:a dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging study[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(1):129-133.

[3] Miyatake K,Muneta T,Ojima M,et al.Coordinate and synergistic effects of extensive treadmill exercise and ovariectomy on articular cartilage degeneration[J].BBMC Musculoskelet Disord,2016,17(1):1-11.

[4] 谢 妮.白藜芦醇对 TNF-α 诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响和调节 Wnt 信号通路的研究[D].四川泸州：四川医科大学,2015.

[5] Yuan X,Liu H,Huang H,et al.The key role of canonical Wnt/β-catenin signaling in cartilage chondrocytes[J].Curr Drug Targets,2016,17(4):475-484.

[6] 杨晓军,苗文丽,裴 林,等.天星健骨胶囊对佐剂性关节炎大鼠足爪组织MMP-2及MMP-9表达的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(1):164-165.

[7] 潘贤峰,杨鑫斌,段培青,等.补肾活血方对家兔骨关节炎滑液中IL-6和MMP-13表达的影响[J].中国医科大学学报,2015,44(10):909-912.

[8] Giganti M G,Tresoldi I,Sorge R,et al.Physical exercise modulates the level of serum MMP-2 and MMP-9 in patients with breast cancer[J].Oncol Lett,2016,12(3):2119-2126.

[9] 崔晓慧,张 微,李媛媛,等.亚砷酸钠对PC12细胞色素上皮衍生因子及凋亡相关因子mRNA表达的影响[J].中华地方病杂志,2016,35(1):10-13.

[10] Zhou Y,Liu S Q,Yu L,et al.Berberine prevents nitric oxide-induced rat chondrocyte apoptosis and cartilage degeneration in a rat osteoarthritis model via AMPK and p38 MAPK signaling[J].Apoptosis,2015,20(9):1187-1199.

[11] Musumeci G,Castrogiovanni P,Trovato F M,et al.Biomarkers of chondrocyte apoptosis and autophagy in osteoarthritis[J].Int J Mol Sci,2015,16(9):20560-20575.

[12] 王倩倩,肖元元,魏 丽.胰升糖素样肽1减少内质网应激的研究进展[J].中华内分泌代谢杂志,2015,31(2):188-191.

[13] Bai X,Kinney W H,Su W L,et al.Caspase-3-independent apoptotic pathways contribute to interleukin-32γ-mediated control ofMycobacteriumtuberculosisinfection in THP-1 cells[J].BMC Microbiol,2015,15(1):39.

[14] 冯全服.从线粒体途径研究川芎嗪诱导HepG2细胞凋亡效应机制[D].江苏南京：南京中医药大学,2015.

[15] Song S,Jacobson K N,McDermott K M,et al.ATP promotes cell survival via regulation of cytosolic Ca2+and Bcl-2/Bax ratio in lung cancer cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2016,310(2):C99-C114.

[16] Selemetjev S A,Savin S B,Paunovic I R,et al.Changes in the expression pattern of apoptotic molecules (galectin-3,Bcl-2,Bax,survivin) during progression of thyroid malignancy and their clinical significance[J].Wien Klin Wochenschr,2015,127(9-10):337-344.

[17] Hou T,Yang X,Xia P,et al.Exercise promotes motor functional recovery in rats with corticospinal tract injury: anti-apoptosis mechanism[J].Neural Regen Res,2015,10(4):644.

[18] Hasaneen N A,Cao J,Pulkoski-Gross A,et al.Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN) promotes lung fibroblast proliferation, survival and differentiation to myofibroblasts[J].Respir Res,2016,17(1):1-14.

[19] Meszaros E C,Dahoud W,Mesiano S,et al.Blockade of recombinant human IL-6 by tocilizumab suppresses matrix metalloproteinase-9 production in the C28/I2 immortalized human chondrocyte cell line[J].Integr Mol Med,2015,2(5):304-310..

[20] Fu J,Li S,Feng R,et al.Multiple myeloma-derived MMP-13 mediates osteoclast fusogenesis and osteolytic disease[J].J Clin Invest,2016,126(5):1759-1772.

[21] Aroui S,Najlaoui F,Chtourou Y,et al.Naringin inhibits the invasion and migration of human glioblastoma cell via downregulation of MMP-2 and MMP-9 expression and inactivation of p38 signaling pathway[J].Tumour Biol,2016,37(3):3831-3839.

[22] Lim X,Tan S H,Yu K L,et al.Axin2 marks quiescent hair follicle bulge stem cells that are maintained by autocrine Wnt/β-catenin signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(11):E1498-E1505.

[23] Takase H M,Nusse R.Paracrine Wnt/β-catenin signaling mediates proliferation of undifferentiated spermatogonia in the adult mouse testis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(11):E1489-E1497.

[24] Takegami Y,Ohkawara B,Ito M,et al.R-spondin 2 facilitates differentiation of proliferating chondrocytes into hypertrophic chondrocytes by enhancing Wnt/β-catenin signaling in endochondral ossification[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,473(1):255-264.

[25] Buchtova M,Oralova V,Aklian A,et al.Fibroblast growth factor and canonical WNT/β-catenin signaling cooperate in suppression of chondrocyte differentiation in experimental models of FGFR signaling in cartilage[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(5):839-850.

EffectofAerobicExerciseonApoptosisofArticularCartilageCellsandExpressionofRelatedGeneProteins

CUI Zhi-yong

(PhysicalEducationCollegeofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan,450044,China)

To investigate the effect of aerobic exercise on the apoptosis of articular cartilage cells and the expression of Bcl-2,Bax,MMP-2,MMP-13,β-catenin,GSK-3β proteins,rabbit knee osteoarthritis (OA) model was established,and the experiment was divided into blank control group,model control group,low intensity exercise group and moderate intensity exercise group.TUNEL labeling method was used to detect the effect of different intensity aerobic exercise on the apoptosis of articular cartilage cells.Western blot was used to detect the expression of Bcl-2,Bax,MMP-2,MMP-13,β-catenin,GSK-3β proteins.Articular cartilage cell apoptosis rates in model control group,low intensity exercise group, moderate intensity exercise group were significantly higher than that in blank control group,and were significantly lower in low intensity exercise group and moderate intensity exercise group than that in model control group,and was significantly lower in low intensity exercise group than that in moderate intensity exercise group (P<0.01);the expression of Bcl-2,Bax,MMP-2,MMP-13,β-catenin,GSK-3β proteins in articular cartilage cells in model group,low intensity exercise group and moderate intensity exercise group were significantly higher than that in blank control group,and Bax protein expression was significantly lower than that in control group;the expression of Bcl-2,Bax,MMP-2,MMP-13,β-catenin,GSK-3β proteins in articular cartilage cells in low intensity exercise group and moderate intensity exercise group were significantly lower than that in the model group,the expression of Bax protein was significantly higher than that in model group；the expression of Bcl-2,Bax,MMP-2,MMP-13,β-catenin,GSK-3β proteins in articular cartilage cells in moderate intensity exercise group were significantly lower than that in low intensity exercise group,and the expression of Bax protein was significantly higher than that in low intensity exercise group (P<0.01).Aerobic exercise at different intensities decreased the apoptosis of articular cartilage cells by regulating Bcl-2 and Bax protein expressions,and down-regulation of MMP-2 and MMP-13 decreased chondrocyte injury,its mechanism may be related to the down-regulation of Wnt/ β-catenin signaling pathway.

rabbit;articular cartilage cell;apoptosis;MMP-2;MMP-13;Wnt/β-catenin signaling pathway

S852.33

A

1007-5038(2017)10-0082-06

2017-02-09

郑州大学体育学院体育教育省级特色专业资助(教高[2012]979号)

崔志勇(1982-),男,河南安阳人，硕士，讲师，主要从事运动人体科学研究。