陈丹妍，蔡雅雯，黄炜雅，王玉婵，王 妍

(细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室/福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108)

鼠伤寒沙门氏菌作为一种人畜共患病最为常见的病原菌之一，由于其耐药性极速形成，多重耐药沙门氏菌分离株出现并迅速传播，严重影响了畜牧业和农业的发展，对公共卫生造成了日益严重的影响[1]。因此消毒剂被广泛地用于沙门氏菌疾病的防治，是食品生产清洗、消毒过程中使用的主要化合物[2-3]。研究发现，消毒剂通常攻击多个部位，整体损伤才会产生杀菌效果[4]。自1935年德国人Domagk[5]发现烷基二甲基氯化铵的杀菌作用以来，季铵盐类抗菌剂的剂型和消毒效果研究一直是消毒领域关注的重点。与传统次氯酸钠、双氧水等常用氧化型消毒剂相比，季铵盐消毒剂具有毒性低、高水溶性、刺激性小和存储使用方便的优点，所以被广泛应用在日常生产生活中[6]。

苯扎氯铵(Benzalkonium chlorides，BACS)消毒剂作为常用的季铵盐消毒剂之一，同时也是一种阳离子表面活性剂，通过破坏脂质膜双层发挥作用，可有效对抗几种光生微生物，尤其是革兰氏阳性菌[7]。眼部感染的细菌大多都为革兰氏阳性菌，例如肺炎链球菌、表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌等[8]，所以一般会在滴眼液中添加抑菌剂苯扎氯铵。常见的氯化钠滴眼液主要成分为氯化钠，其中加入了苯扎氯铵，还含有玻璃酸钠等成分，主要用于缓解眼睛疲劳引起的局部干涩[9]。使用氯化钠作为滴眼液的主要成分，主要是因为其与人体生理环境最为接近，但是否能使苯扎氯铵抑菌效果达到最好，还未有明确的证据，可能存在其他介质能使苯扎氯铵发挥更好的作用也未可知。

在很长一段时间里，基于细菌不能同时形成多种耐药性机制的假设，对消毒剂或消毒剂的耐药性并没有引起人们的重视[10]。然而，在三氯生这一常用阳离子消毒剂的具体耐药机理被报道后[11-12]，对季铵盐等其他阳离子剂的耐药机理的重新评价引起了研究者们的极大关注[13]。尽管苯扎氯铵的杀菌机制是非特异性的[14]，但已经出现了耐性突变体，这表明细菌的适应性，尤其是沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌[15]。例如，苯扎氯铵广泛用于农牧业的消毒以及食品行业的表面、器具和仪器消毒，这导致鼠伤寒沙门氏菌已经对苯扎氯铵逐渐产生耐药性[1]。

为了减缓鼠伤寒沙门氏菌对苯扎氯铵的耐药性，因此本试验开始探究苯扎氯铵杀灭鼠伤寒沙门氏菌效果最好的条件，首先在ddH2O和0.9% NaCl介质中做了尝试，发现在0.9% NaCl介质中会抑制苯扎氯铵的杀菌效果。随后在6种不同介质中进行验证，再通过添加8种不同的氨基酸进行试验，最终发现是介质中解离的阴离子会抑制其杀菌效果。为了排除菌种特异性，在典型的耐药菌肺炎克雷伯氏菌及金黄色葡萄球菌中也验证了这一现象。通过本研究结果，期望能最大限度地发挥苯扎氯铵的作用，并减缓细菌对其产生的耐药性，减轻农牧业发展的负担。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌SL1344、肺炎克雷伯氏菌KP-D367、金黄色葡萄球菌ATCC25923，由细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室保藏。

1.2 试验药品与仪器

试剂药品：苯扎氯铵(BACS)、氯化钠(NaCl)、二甲基亚砜(DMSO)、葡萄糖(Glucose)、正丁醇(1-Butanol)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)。以上药品配制成溶液后均经过0.22 μm微孔滤膜过滤确保无菌后备用。

试剂药品及使用浓度：BACS储液(25 mg·mL-1)、NaCl(0.9%)、DMSO(1%)、Glucose(10 mmol·L-1)、1-Butanol(0.3 mol·L-1)、KCl(100 mmol·L-1)、CaCl2(100 mmol·L-1)、MgCl2(100 mmol·L-1)、8种氨基酸Leu/Met/Cys/Gly/Asp/Glu/Lys/Arg(10 mg·mL-1) 。

1.3 试验方法

1.3.1菌种活化及稀释点板方法 (1)活化菌种。取-80℃冻存的细菌菌液2 μL，加入到1 mL LB液体培养基中，于摇床(37℃、220 r·min-1)过夜培养进行菌种活化，所得菌液以1∶500的比例接种于LB液体培养基中，于摇床(37℃、220 r·min-1)培养24 h，即得平台期细菌菌液。(2)稀释点板。处理并洗涤后的所得菌液按每次10倍的梯度用PBS缓冲液稀释，稀释梯度为101、102、103、104、105，每个稀释度取4 μL菌液点在LB固体培养基平板上，倒置于37℃恒温培养箱12 h后，检查细菌死亡并进行计数，计算细菌经处理后的存活率。

1.3.2苯扎氯铵在ddH2O和0.9% NaCl介质中杀灭平台期鼠伤寒沙门氏菌效果的差异 取平台期鼠伤寒沙门氏菌50 μL的菌液离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，单处理组分别用100 μL ddH2O和0.9% NaCl溶液重悬菌体，双处理组分别用100 μL含苯扎氯铵的ddH2O和0.9% NaCl溶液重悬菌体，苯扎氯铵终浓度分别设定为40、50、60、70、80 μg·mL-1，处理时间设定为3 min。处理时间结束后立即离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS缓冲液重悬菌体，洗涤2次后，再加入50 μL PBS缓冲液重悬菌体。

1.3.3在6种不同介质中验证苯扎氯铵杀灭平台鼠伤寒沙门氏菌效果的差异 发现在ddH2O和0.9% NaCl介质中苯扎氯铵的杀菌效果存在很大的差异后，首先分析了ddH2O与0.9% NaCl的化学性质，再结合苯扎氯铵的成分及杀菌机制，猜想可能是由于NaCl会在溶液中解离成Na+和Cl-，溶液中存在的离子会抑制苯扎氯铵的杀菌效果。因此随机挑选了2大类共6种介质，第1类是DMSO、葡萄糖及正丁醇，在溶液中不会解离；第2类是KCl、CaCl2及MgCl2，在溶液中会发生解离。

取平台期鼠伤寒沙门氏菌50 μL的菌液离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，单处理组分别用100 μL含1% DMSO、10 mmol·L-1Glucose、0.3 mol·L-11-Butanol、100 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1CaCl2、100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重悬菌体，双处理组分别用100 μL含苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+1% DMSO、苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+10 mmol·L-1Glucose、苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+0.3 mol·L-1正丁醇、苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1KCl、苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1CaCl2、苯扎氯铵(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重悬菌体，处理时间设定为3 min。处理时间结束后立即离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS缓冲液重悬菌体，洗涤2次后，再加入50 μL PBS缓冲液重悬菌体。

1.3.4添加8种不同氨基酸验证苯扎氯铵杀菌受到阴离子(负电)的抑制 发现苯扎氯铵在溶液中会解离的介质里杀菌效果会受到很大的抑制，但仅验证了是解离的离子影响了苯扎氯铵的杀菌效果，是溶液中的阳离子还是阴离子影响更大有待研究。因此随机挑选了4大类共8种氨基酸，第1类是非极性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸，第2类是极性不带电氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸，第3类是极性带正电氨基酸中的精氨酸和赖氨酸，第4类是极性带负电氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸。通过在水溶液中分别添加这8种氨基酸，作为苯扎氯铵的杀菌介质，开展了本阶段的试验来验证是阳离子还是阴离子抑制苯扎氯铵的杀菌效果。

取平台期鼠伤寒沙门氏菌50 μL的菌液离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，单处理组分别用100 μL含10 mg·mL-1亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸的水溶液重悬菌体，双处理组分别用100 μL含60 μg·mL-1苯扎氯铵的亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸的水溶液重悬菌体，处理时间设定为3 min。处理时间结束后立即离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS缓冲液重悬菌体，洗涤2次后，再加入50 μL PBS缓冲液重悬菌体。

1.3.5在平台期肺炎克雷伯氏菌及金黄色葡萄球菌中验证介质对苯扎氯铵杀菌的影响 为了排除菌种特异性，本阶段也随机挑选本试验室现有保藏的两种菌，一种为典型的革兰氏阴性菌肺炎克雷伯氏菌，一种是典型的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。在这两种菌中验证是否苯扎氯铵的杀菌也存在被阴离子抑制的现象。

分别取平台期肺炎克雷伯氏菌及金黄色葡萄球菌50 μL的菌液离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，单处理组分别用100 μL ddH2O和0.9 % NaCl溶液重悬菌体，双处理组分别用100 μL含苯扎氯铵的ddH2O和0.9 % NaCl溶液重悬菌体，处理肺炎克雷伯氏菌时苯扎氯铵终浓度分别设定为80、90、100 μg·mL-1，处理金黄色葡萄球菌时苯扎氯铵终浓度分别设定为100、120、150 μg·mL-1，处理时间设定为3 min。处理时间结束后立即离心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS缓冲液重悬菌体，洗涤2次后，再加入50 μL PBS缓冲液重悬菌体。

1.4 数据处理与分析

试验中的数据统计通过ANOVA方差分析，数据来源于3次独立试验。

2 结果与分析

2.1 苯扎氯铵在ddH2O和0.9% NaCl介质中杀灭平台期鼠伤寒沙门氏菌效果的差异

由图1可知，苯扎氯铵处理时间都为3 min时，40 μg·mL-1的浓度在ddH2O介质和0.9% NaCl介质中杀菌效果差异并不大，仅差异1个数量级。但随着苯扎氯铵浓度的提高，处理时间不变的条件下，在两种介质中杀菌效果差异显著。对比ddH2O介质，在0.9% NaCl介质中苯扎氯铵的杀菌效果明显变差，在80 μg·mL-1的浓度时，二者差异达到5个数量级。说明苯扎氯铵的杀菌受到了0.9% NaCl的抑制。因此，本试验发现在苯扎氯铵浓度相同及处理时间一致的条件下，仅改变苯扎氯铵的介质，就导致杀菌效果存在极大差异。

图1 苯扎氯铵在ddH2O和0.9% NaCl介质中杀灭平台期鼠伤寒沙门氏菌效果的差异Fig.1 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period in the medium of ddH2O and 0.9% NaCl

2.2 在6种不同介质中验证苯扎氯铵杀灭平台期鼠伤寒沙门氏菌效果的差异

由图2可知，苯扎氯铵浓度都为60 μg·mL-1时，苯扎氯铵在6种不同介质中杀菌效果都存在差异，主要可以分为2类。在DMSO、葡萄糖及正丁醇介质中，苯扎氯铵杀菌效果明显，与DMSO、葡萄糖及正丁醇单处理组相比差异极显著(P<0.000 1)；而在KCl、CaCl2及MgCl2介质中，苯扎氯铵杀菌效果很差，与KCl、CaCl2及MgCl2介质单处理组相比差异不显著(P>0.05)。本试验发现在不会解离的介质DMSO、葡萄糖及正丁醇中，苯扎氯铵的杀菌效果显著，说明其杀菌效果不会受到抑制；而在会解离的介质KCl、CaCl2及MgCl2中，苯扎氯铵基本没有杀菌效果，说明其杀菌效果会受到明显的抑制。

注：****表示P<0.000 1；NS表示P>0.05图2 在6种不同介质中验证苯扎氯铵杀灭平台期鼠伤寒沙门氏菌效果的差异Fig.2 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period tested in six different media

2.3 添加8种不同氨基酸验证苯扎氯铵杀菌受到阴离子(负电)的抑制

由图3可知，在水溶液中分别添加非极性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸、极性不带电氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸及极性带正电氨基酸中的精氨酸和赖氨酸，苯扎氯铵的杀菌效果明显，与单处理组相比差异极显著(P<0.000 1)。而在水溶液中分别添加极性带负电氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸，苯扎氯铵的杀菌效果较其他类氨基酸明显变差，与单处理组相比差异较显著(P<0.01)。因此可以得出结论，苯扎氯铵的杀菌效果受到阴离子的抑制，也就是受到负电的影响。

注：****表示P<0.000 1；**表示P<0.01图3 添加8种不同氨基酸验证苯扎氯铵杀菌受到阴离子(负电)的抑制Fig.3 Addition of eight different amino acids to verify the inhibition of bactericidal effect of benzalkonium chloride by anions (negative electricity)

2.4 在平台期肺炎克雷伯氏菌及金黄色葡萄球菌中验证介质对苯扎氯铵杀菌的影响

由图4A和图4B可知，在肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌中，苯扎氯铵对比在ddH2O介质与0.9% NaCl介质中，在ddH2O介质中杀菌效果比在0.9% NaCl介质中显著。因此可以得出结论，在肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌中苯扎氯铵的杀菌也存在被阴离子抑制的现象，而非苯扎氯铵对鼠伤寒沙门氏菌的特异性。

图4 在平台期肺炎克雷伯氏菌及金黄色葡萄球菌中验证介质对苯扎氯铵杀菌的影响Fig.4 Effect of the medium on the sterilization of benzalkonium chloride tested in Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus at platform period

3 结论与讨论

目前，畜禽细菌耐药研究已受到国内外研究人员的广泛关注，已有大量关于畜群细菌耐药的研究报道，但未见我国从致病菌的角度，对来源于病死畜禽的多种潜在致病菌的研究报道[16-17]。研究者们大都聚焦于抗生素的增效减毒及新型抗生素的研发，但新抗生素的研发及批准上市又陷入极为艰难的境地，所以寻找对沙门氏菌具有杀菌活性的其他药物迫在眉睫，可以显著降低新型抗生素研发的压力。因此本研究想从鼠伤寒沙门氏菌和苯扎氯铵入手，对其耐药性做一个深入的探究。

未来，对苯扎氯铵耐药突变体的发病机制和流行病学研究将变得越来越重要[10]。本研究的发现有助于进一步了解更好的消毒剂使用方法，那就是在不同的环境下可以特异性选择不同的消毒剂来进行消毒。在生产和使用苯扎氯铵时，就可通过此方法来优化苯扎氯铵，例如苯扎氯铵溶剂的选择以及在不具有或只有少数阴离子的环境下选择苯扎氯铵消毒剂来进行消毒。然而关于此现象，本研究仅发现并初步验证，还需要进行后续研究，深入探究苯扎氯铵杀菌是如何受到阴离子的抑制，对其具体作用机制进行解释。日后以期本研究结果能够将苯扎氯铵在农牧业中应用得更加规范，使其杀菌效果良好又不易产生耐药性，以此协助农牧业进一步发展。