秦 庆 胡 瑛 吕永强

中国人民解放军第210医院检验科，辽宁大连 116021

痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、T-SPOT.TB在肺结核诊断中的临床意义

秦 庆 胡 瑛 吕永强▲

中国人民解放军第210医院检验科，辽宁大连 116021

目的 比较痰涂片抗酸染色﹑结核抗体试验﹑荧光PCR和结核感染T细胞斑点试验在肺结核诊断中的价值。 方法 96例经肺结核诊断和治疗指南标准确诊为肺结核患者设为实验组，56例其他肺部疾病（非肺结核）患者设为对照组，用上述四种方法同时进行检测。计算每种方法的灵敏度﹑特异度﹑准确性，并进行四种检测方法之间的配对χ2检验。 结果 痰涂片抗酸染色﹑结核抗体试验﹑荧光PCR﹑T-SPOT.TB检测的灵敏度分别为11.46%﹑44.80%﹑38.54%和93.75%，特异度分别为98.96%﹑82.14%﹑94.64%﹑91.10%，准确性分别为43.42%﹑58.55%﹑59.21%﹑92.76%，四种方法两两之间比较差异均有统计学意义。 结论 每种方法各有优缺点，综合评价T-SPOT.TB检测方法优于其他三种方法。工作中，应多种检测方法联合使用，以便对肺结核做出正确的诊断。

抗酸染色；结核抗体试验；TB-DNA；T-SPOT.TB；肺结核

结核病是由于结核分枝杆菌感染人体各个器官而引起的一种慢性传染病，其主要侵袭的是肺部脏器，作为危害人类健康的传染病之一，是中青年人的重要死因[1]。结核病之所以得到全世界的重视，不仅仅是发病率高，其死亡率长期以来一直居高不下，最主要原因是缺少快速有效的检测方法[2]。结核病的临床表现复杂多样，对临床医生诊断该病带来了很大的障碍。目前结核病的普查方法是结核菌素试验，该方法在全世界广泛的应用，但在我国由于非结核分枝杆菌感染率较高，因此TST出现了较多的假阳性，而免疫力低下的患者，又会出现一定的假阴性[3]。所以找出一种能够早期快速检测结核病的方法来替代结核菌素试验，对疾病的控制﹑死亡率的降低至关重要。因此本研究针对肺结核检测分别开展了痰涂片抗酸染色﹑结核抗体试验﹑荧光PCR和结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）四种方法的诊断能力研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在2016年1～12月收入本院的96例肺结核患者（均符合肺结核诊断和治疗指南标准）为实验组，其中男58例，女38例，年龄23～85岁；56名非肺结核疾病患者为对照组，其中男35例，女21例，年龄25～77岁；其中不包括孕妇，免疫抑制等患者，上述患者均签署知情同意书，分别对两组进行痰涂片抗酸染色﹑结核抗体试验﹑荧光PCR和结核感染T细胞斑点试验检测。

1.2 试剂

抗酸染液（北京华越洋生物有限公司），结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（MP生物医学亚太私人有限公司），结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（艾康生物技术有限公司），结核感染T细胞检测试剂盒（上海信长医疗器械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰涂片抗酸染色 与清晨取患者深咳脓性痰，收集在无菌密闭容器中，加入少量生理盐水稀释，取少量涂在载玻片上，然后进行抗酸染色，染色完成后置于显微镜下观察100个视野，如发现结核分枝杆菌≥3个，则该患者诊断为阳性，记录阳性患者例数。1.3.2 结核抗体试验 采用促凝管取患者静脉血，离心10min，按照结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（MP生物医学亚太私人有限公司）的使用说明书，进行规范操作，并记录结果。1.3.3 TB-DNA 利用试剂盒（艾康生物技术有限公司）选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Tap酶的外切酶活性将5′端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3′端荧光猝灭集团的屏蔽，能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光。本次采用定性检测结核分枝杆菌的方法，严格遵照结核分枝杆菌

核酸检测试剂盒说明书，进行规范的操作。

1.3.4 T-SPOT.TB 采用肝素或柠檬酸钠抗凝剂采血管抽取8mL外周静脉血，样本采集后尽快进行外周单个核细胞的分离，按照结核感染T细胞检测试剂盒（上海信长医疗器械有限公司）的说明书进行操作。T-SPOT试剂盒设有空白对照孔﹑阳性对照孔﹑分别以ESAT-6和CFP-10抗原为刺激物的反应孔，通过计数斑点来判断病人是否被结核杆菌感染。当出现以下三种情况结果被认为是不确定的：（1）空白对照孔超过10个这种情况下需要重新复查。（2）阳性质控对照孔少于20个。（3）当空白对照对照孔数为0～5个并且反应孔斑点数减去空白对照孔等于5～7时，需要复查。当空白对照没有或者很少的斑点而阳性质控对照孔的斑点数超过20个，表明检测结果是有反应性的，以下两种情况结果为阳性：（1）当空白对照孔斑点数为0～5个时，（任意一个反应孔的斑点数）-（空白对照的斑点数）≥6；（2）当空白对照孔斑点数为6～10个时，（任意一个反应孔的斑点数）≥2×（空白对照的斑点数）。

1.4 统计学处理

采用统计学软件SPSS19.0版对数据进行统计分析，计数资料采用百分数（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者四种检测方法结果见表1～2。总计152例受检者中，痰涂片抗酸染色检测阳性为12例，占7.9%，阴性140例，占92.1%；结核抗体试验检测阳性为53例，占34.9%，阴性99例，占65.1%；TBDNA检测阳性为40例，占26.3%，阴性112例，占73.7%；T-SPOT.TB检测阳性为95例，占62.5%，阴性57例，占37.5%。四种方法两两之间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 实验组四种检测方法结果

表2 对照组四种检测方法结果

表3 四种方法的配对检测分析

3 讨论

痰涂片抗酸染色是利用结核分枝杆菌的细胞壁上的脂类不容易着色，对其延长染色的时间，细胞壁上的脂类着色后，不容易被酸性脱色剂脱去，通过显微镜观察视野中是否有被染成红色的结核杆菌，来判断临床疑似肺结核的患者是否被结核分枝杆菌感染，这种方法具有操作方便﹑价格便宜的优点[4]，是经典的细菌学诊断方法。对于不能进行分枝杆菌培养的实验室来说，抗酸染色可以视为诊断肺结核的金标准，但是结果阳性不能够说明视野中是结核分枝杆菌，有可能是非结核分枝杆菌﹑麻风杆菌等细菌的感染，同时显微镜检查存在一些主观因素，例如检验人员涂片的质量﹑染色时间﹑镜检的经验等，标本留取合格率低，也会影响阳性率。另外还与患者疾病所处的阶段有关，患者在排菌期抗酸染色阳性率很高，如果不在排菌期很难检出结核杆菌[5]，并且通过显微镜也无法区分结核杆菌的死活。虽然其特异度是上述四种方法中最高的，达到98.96%，其诊断非病人能力较强，但灵敏度却是最低的，仅为11.46%，故漏诊率很大，该方法准确性为43.42%，也是四种方法中最低的。即使痰涂片未见结核杆菌，也不可排除结核病的可能性，所以在诊断肺结核病时要结合临床症状和影像学检查等[6]。

结核抗体试验依据结核病是一种由结核分枝杆菌感染后引起的机体慢性肉芽肿和一系列免疫反应所介导的疾病，通过检测机体免疫反应产生的特异性抗体来诊断结核病，具有方便﹑快速﹑可重复，特异性高等优点[7]。有文献报道称结核抗体试验可以作为儿童﹑不方便留取痰标本者和肺外结核病诊断的重要指标[8]。但是机体对外界刺激产生的免疫反应的强度和持续时间存在个体性差异，部分病人虽然肺结核正处于静止期，但血清中的抗结核抗体会持续一定的滴度，使检测结果出现阳性，增加了检测的假阳性率，对医生判断患者的病情起到一定的干扰作用[9]。同时结核抗体检测的干扰因素也很多，如患者存在自身免疫病，自身免疫性抗体将可能影响结核抗体试验检测结核抗体的特异性，造成结果的假阳性[10]。因此该方法假阳性率最高，由表中看出结核抗体试验的特异度是最低的，为82.14%，误诊率较高，而灵敏度为44.80%，漏诊率也较高，方法准确性为58.55%。

常规PCR检测结核感染时，需要将样本中的核酸扩增，然后进行电泳，虽然速度比较快，但很容易出现交叉感染等缺点，会影响检测的特异度。近些年兴起的荧光PCR方法，可以很好的弥补常规PCR的不足，所以本次实验应用荧光PCR技术检测结核杆菌核酸，由表中结果可以得出TB-DNA的特异度比较高，为94.64%，但是阳性率不高，灵敏度为38.54%，漏诊率较大，这是由于样本取材方面要求很严格，不容易取到含有结核分枝杆菌的样本。在对照组出现的假阳性可能与以下两种因素有关：（1）患者处于结核分枝杆菌感染的“亚临床”状态；（2）可能存在两种疾病并存即双重感染[11]。该方法综合准确性为59.21%。T-SPOT.TB检测技术是利用机体受结核杆菌刺激会引发免疫反应，产生效应T细胞和记忆T细胞，记忆T细胞会长期存在于人体，通过将患者外周血细胞分离，得到记忆T细胞，然后利用相同的抗原再次刺激，记忆T细胞就会转变成效应T细胞并且分泌细胞因子γ干扰素，被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，加入酶标二抗，洗去未标记的抗体，在反应孔内加入底物，就会形成色素沉着的斑点，每个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，计数斑点数量，得出外周血中结核致敏T细胞的数量。

T-SPOT.TB的优点在于它对检验的要求较低：（1）不受免疫力状态的影响；（2）与患者是否在排菌期，排菌量无关[12]。因此在此次研究中该方法的灵敏度最高，达到93.75%，远远高于另外三种方法，而其特异度为91.10%，虽有一定的假阳性，但仍在可接受范围内，方法准确性最终达到92.76%，该方法整体优于其它三种方法。T-SPOT.TB技术不仅可以用于检测外周血，还能应用于支气管肺泡灌洗液﹑痰液﹑胸腹水及脑脊液等标本进行检测[13]。霍菲菲等[14]对31例肺外结核的患者进行T-SPOT.TB检测，灵敏度为93.5%，陶学芳等[15]对30例肺外结核病患者用T-SPOT.TB检测，灵敏度为93.33%，说明T-SPOT.TB在肺外结核病诊断上有较高的敏感性，所以这项技术还可以应用在临床辅助诊断肺外结核病上。

对四种检测方法之间进行配对χ2检验，结果P值最大为0.029，满足P＜0.05，因此认为这四种方法两两之间比较差异均有统计学意义。

综上所述，痰涂片抗酸染色作为经典方法在排除非患者方面具有明显价值，结核抗体试验具有快速检测的能力，PCR检测特异度较高，T-SPOT.TB检测灵敏度明显高于其它方法。虽然没有一种方法可以在所有诊断指标上都表现优秀，但综合评价，T-SPOT.TB检测方法还是优于其他三种方法，特别可以作为肺结核病早期诊断的一项有效检查手段，也可以发现那些需要定期随访的潜伏性患者。在实际工作中，如果有条件应选择多种方法联合检测，并结合患者的病史﹑临床症状﹑影像病理等资料，对肺结核做出正确的诊断，有效减少误诊﹑漏诊的发生。

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Clinical significance of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescent PCR and T-SPOT.TB in the diagnosis of pulmonary tuberculosis

QIN Qing HU Ying LV Yongqiang
Department of Clinical Laboratory,the 210th Hospital of PLA,Dalian 116021,China

Objective To compare the value of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescent PCR and tuberculosis infection T cell spot test (T-SPOT.TB) in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods 96 patients with pulmonary tuberculosis diagnosed by the criteria of diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis were set as experimental group,56 patients with other lung diseases(non tuberculosis) were divided into control group,the above four methods are used for simultaneous detection.The sensitivity,specificity and accuracy of each method were calculated,The paired χ2test between four detection methods was carried out. Results The sensitivity of acid fast staining of sputum smear,tuberculosis antibody test,fluorescence PCR and T-SPOT.TB was 11.46%,44.80%,38.54% and 93.75% respectively,the specificity was 98.96%,82.14%,94.64%,91.10%respectively,the accuracy were 43.42%,58.55%,59.21% and 92.76%, respectively,the differences between two methods were statistically significant. Conclusion Each method has advantages and disadvantages,the comprehensive evaluation method of T-SPOT.TB is better than the other three methods,Multiple detection methods should be used in combination in the work,in order to make the correct diagnosis of pulmonary tuberculosis.

Acid fast staining;Tuberculosis antibody test;TB-DNA; T-SPOT.TB;Pulmonary tuberculosis

R521

A < class="emphasis_bold"> [文章编号]]

] 2095-0616（2017）21-130-04

▲通讯作者

2017-08-31）