陈俊晖+漆子钰+骆亮+刘梓富+吴沙沙+翟俊文+彭东辉

摘要：金边朱砂根是个叶果俱佳的品系，由于其挂果量极少，有性繁殖的后代容易出现性状分离，不利于优良性状的稳定遗传，采用种子繁殖出的种苗远不能满足市场的需求，因此亟须采用组培快繁体系进行种苗的扩繁。以金边朱砂根的茎段为外植体，采用单因素和正交试验法研究不同灭菌方式、基本培养基和植物生长调节剂对金边朱砂根茎段灭菌、初代培养、继代增殖培养、生根培养的影响。结果表明：最佳的灭菌方式为0.1% HgCl2消毒8 min；初代培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，启动率为73.33%；继代增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+ 0.1 mg/L噻重氮苯基脲（TDZ），增殖系数为4.27；生根培养基为1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率为71.11%。

关键词：金边；朱砂根；组织培养

中图分类号： S359文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0050-04

紫金牛属（Ardisia）常绿小灌木，性喜阴凉，初夏开花，花白色略带粉色，7月底结成青色果实，果实于10～12月成熟转红[1]。果实多，颜色红艳，挂果期长，而且果期在春节期间，常作为年宵花卉的首选[2]。金边朱砂根是由朱砂根变异种筛选出来的彩叶类型，是个叶果俱观的品系。但是，目前具有该变异的植株较少并且挂果量极少，无法满足生产上对种苗的需求。植株通过有性繁殖的后代容易出现性状分离，不利于优良性状的稳定遗传，而且繁殖周期较长。为了在短时期内获得大量生长健壮的种苗。本研究通过对金边朱砂根快繁体系的各个阶段进行研究，力求建立一套可生产应用、高效的金边朱砂根组培快繁体系，从而为金边朱砂根种质资源保存提供参考，并为金边朱砂根种苗快繁提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

晴朗午后从金边朱砂根盆栽母株（图1）上选取生长健壮、无病虫害的当年生带腋芽茎段作为外植体。

1.2试验方法

1.2.1外植体灭菌方案的筛选采集试验材料后用适当浓度洗涤剂将茎段清洗干净，用自来水冲洗30 min后置于超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用无菌水冲洗2遍，再用 0.1% HgCl2（添加吐温20）、2% NaClO进行不同时间消毒处理（表1）。灭菌剂消毒完后用无菌水冲洗3～5遍，在无

1.2.3继代培养基的筛选以MS培养基为基本培养基，采用3因素3水平正交试验设计（表3）， 将初代培养30 d的朱

水平因素A：基本培养基B：6-BA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）1MS0.50.121/2 MS1.00.23WPM2.00.3

砂根组培苗切为约1.5 cm长的茎段，分别接种于继代培养基上，每个处理接种30个外植体，重复3次，30 d后统计增殖系数。培养条件同初代培养。

1.2.4生根培养基的筛选以大量元素按比例配制的MS培养基+IBA、NAA溶液作为试验因素，设计3因素3水平正交试验（表4），从继代增殖培养40 d的朱砂根组培苗上切取带单个芽的外植体，接种于生根培养基上，每个处理接种30个外植体，重复3次，30 d后统计生根率、平均生根数。培养条件同初代培养。

表4生根培养基配方L9（34）正交设计

水平因素A：基本培养基B：IBA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）11/2 MS0.50.023/4 MS1.01.03MS2.02.0

1.2.5数据分析采用Excel 2003、SPSS 19.0分析软件对试验数据进行处理与统计分析。各指标计算公式：污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%；死亡率=死亡外植体数/接种外植体数×100%；启动率=启动生长的外植体数/接种外植体数×100%；增殖系數=增殖后芽数/接种外植体数；生根率=生根株数/接种株数×100%；平均生根数=生根根数/接种不定芽数。

2结果与分析

2.1外植体灭菌结果

从表5可以看出，用0.1% HgCl2作灭菌剂时随着消毒时间的增加，外植体的污染率下降，而死亡率先下降后上升；在消毒8 min时的死亡率极显著低于其他消毒时间，仅为 11.67%；当用2% NaClO消毒10 min时，外植体死亡率最高，达到93.33%；而用0.1% HgCl2消毒12 min时，外植体死亡率也达到较高水平，为80.00%。从污染率、死亡率的控制考虑，用0.1% HgCl2消毒8 min是最佳的灭菌方式。

2.2初代培养

将灭菌过的茎段切取带腋芽部分1.5 cm接到不同的基本培养基+不同质量浓度的6-BA、NAA进行金边朱砂根茎段的芽诱导启动培养。培养15 d后，第1、2、5组培养基中外植体的顶端和叶腋处开始萌动生长，长出2～3个不定芽。

从表6可以看出，在初代启动培养过程中，不同基本培养基和激素组合对金边朱砂根茎段启动培养的影响效果差别很大。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA组合下，启动率最高，达到73.33%。正交试验设计的极差R值决定各因素对金边朱砂根茎段启动生长的影响程度依次为A>B>C，即基本培养基>6-BA>NAA，最佳的组合为A1B2C3。

由方差分析得出，基本培养基的P值=0.018<0.05，6-BA的P值=0.033 5<0.05，NAA的P值=0.656>0.05，基本培养基和6-BA对金边朱砂根茎段启动率的影响显著，NAA对其影响不显著。进一步用LSD法多重比较3种因素对金边朱砂根继代增殖的影响。不同基本培养基的多重比较表明，MS与1/2 MS差异显著，MS与WPM差异极显著，1/2MS 与WPM差异不显著。所以基本培养基为MS、1/2MS时均有利于金边朱砂根茎段启动，WPM效果较差。6-BA不同浓度水平的多重比较表明，0.5 mg/L处理与1.0 mg/L处理差异显著，1.0 mg/L处理与2.0 mg/L处理差异显著，0.5 mg/L 处理与2.0 mg/L处理差异不显著。6-BA浓度为1.0 mg/L时启动生长效果最好，明显高于浓度为0.5、2.0 mg/L 时的启动率，说明适宜浓度的6-BA对金边朱砂根茎段启动生长有促进作用，但是过高则会抑制。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA组合处理下的朱砂根茎段培养15 d即启动生长，顶端、叶腋处开始长芽，且长势明显优于其他处理。

2.3继代培养

将茎段初代启动培养长出的不定芽切成单个芽转接到继代培养基中进行增殖，基本培养基选取前面试验中效果最好的MS，添加不同质量浓度的6-BA、NAA和TDZ组合，对继代增殖培养基进行优化。

2.4生根培养基的筛选结果

将继代增殖中的不定芽切去2 cm作生根材料，在按不同大量元素比例配制的改良MS培养基上添加不同质量浓度的NAA、IBA进行生根培养，40 d后统计生根率和平均生根数。从表8可以看出，在生根培养过程中，不同基本培养基和生长素组合对生根的影响差异较大。在1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA组合下，生根率最高，为71.11%，平均生根数最多，达到4.18条。

由方差分析得出，基本培养基的P值=0.008<0.01，IBA的P值=0.024<0.05，NAA的P值=0.250>0.05，基本培养基和IBA对金边朱砂根茎段生根率的影响显著或极显著，NAA对其影响不显著。进一步用LSD法多重比较3种因素对金边朱砂根继代增殖的影响。不同基本培养基的多重比较表明，1/2 MS处理与3/4 MS处理差异显著，1/2 MS处理与MS处理差异极显著，3/4 MS处理与MS处理差异显著。基本培养基为1/2 MS、3/4 MS时生根率明显高于MS，可以看出减少培养基的含盐量有利于提高金边朱砂根茎段的生根率。IBA不同浓度水平的多重比较表明，0.5 mg/L处理与10 mg/L处理差异显著，1.0 mg/L处理与2.0 mg/L处理差异显著，0.5 mg/L 处理与2.0 mg/L处理差异不显著（表8）。IBA浓度为0.5、1.0 mg/L时均有利于提高金边朱砂根茎段生根率，2.0 mg/L处理效果较差。正交试验设计的极差R值决定各因素对金边朱砂根生根率的影响程度依次为A>B>C，即基本培养基>IBA>NAA，最佳的组合为A1B2C2。朱砂根金边组织培养发育过程见图2。

3讨论与结论

3.1讨论

不同植物所需的灭菌剂和处理时间存在差异，灭菌方式的选择与植物的表皮结构和选取部位的木质化程度有关。植物的表皮带绒毛或者木质化程度越高，所需的灭菌剂灭菌时间就越久。但如果处理时间过长，灭菌剂会很难去除，残留的灭菌剂会毒害植物，不利于其生长。所以，选择合适的灭菌剂和处理时间是外植体组培快繁体系建立的第1步[3]。

表明，选用0.1% HgCl2作为灭菌剂比具有强氧化性的2% NaClO消毒后培养的外植体死亡率更低，对外植体的伤害更小。消毒时间为8 min时外植体的污染率和死亡率均较低，所以选用0.1% HgCl2消毒8 min的灭菌方式。

马明东等在研究植物生长调节剂对朱砂根外植体初代培养的影响试验中，分析得出植物生长调节剂6-BA、NAA两者浓度比值在10以内时萌芽率较高，可达80.00%以上[4]。其中培养基配方MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA对芽的诱导率显著高于其他处理，是腋芽诱导的最佳培养基，与孔祥海等的研究结果[5]一致。但在本研究中，最佳的芽诱导初代培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA，启动率达73.33%。很多研究表明，即使是同种植物的不同品种在组织培养过程中仍存在较大差异，这种差异主要体现在不同品种启动培养的难易程度[6]、培养过程中所需要的生长调节剂浓度和基本培养基类型[7]，而且这种差异体现在启动、增殖、生根培养的各个阶段。金边朱砂根对于6-BA、NAA的质量浓度的要求明显高于朱砂根原种，这也证明了上述差异。很多木本植物使用WPM基本培养基的效果好于MS，而对于金边朱砂根MS基本培养基启动生长的效果明显优于WPM。本研究中，最佳继代增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系数为4.27。TDZ是一种具有细胞分裂素活性的取代脲类化合物，具有促进植物芽的诱导与增殖功能。在本研究中，加入低浓度的TDZ对于金边朱砂根的继代增殖有显著的促进作用，是金边朱砂根继代增殖的主导因素，与孙晓敏等在光皮樺组织培养离体再生方面的研究结果[8]一致。1/2 MS培养基的大量元素含量为MS的1/2，本研究中生根培养阶段结果表明，1/2 MS更有利于金边朱砂根的生根，而高盐的MS最不利于其生根，此结论与众多试验中植物生根培养时低盐的培养基生根效果更好的结论一致。植物生长素的组合对生根有促进作用[9]，在IBA 浓度相同时，增加NAA的浓度到1.0 mg/L对金边朱砂根的生根率也有促进作用。金边朱砂根最佳的生根培养基为 1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，此组合下生根率达到71.11%，平均生根数为 4.18 条，整体生根效果最好。

3.2结论

最佳金边朱砂根的灭菌方式为0.1% HgCl2消毒8 min；最佳的初代培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，启动率为73.33%，达到启动培养的要求；最佳的继代增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系数为4.27；最佳生根培养基为1/2 MS+10 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率为71.11%，且根系粗壮。

参考文献：

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