侯婉晴，郭晓萌，罗利华，范玉玲，游 剑*



一种纳米级超声造影剂的制备及其性质考察

侯婉晴1,2，郭晓萌2，罗利华2，范玉玲1*，游 剑2*

(1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所, 黑龙江哈尔滨 150028; 2. 浙江大学药学院, 浙江杭州 310058)

研制一种纳米级的超声造影剂，并评价其体内外超声显像的效果。利用薄膜-超声法制备纳米级超声造影剂，通过正交试验设计筛选出最佳处方。制作质量分数1%琼脂糖凝胶孔洞模型，以磷酸盐缓冲液为阴性对照，评价自制超声造影剂的显像效果。选择4T1荷瘤小鼠为研究对象，尾静脉注射造影剂24 h后，对其肿瘤部位进行超声成像分析。通过正交试验筛选出的最佳处方为以蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂质量比1∶1作为膜材料，全氟己烷的体积分数为3%，制备得到的造影剂粒径为（304.0±19.2）nm，多分散指数(PDI)为0.171±0.032，且在10 d内较稳定；体外显像实验发现造影剂可以显著增强回声信号；体内超声显像实验发现造影剂可以大量累积到肿瘤内部，同时增强肿瘤内部的回声信号。自制的超声造影剂性质稳定，超声显像效果好，为肿瘤的超声诊断与治疗相结合奠定基础。

药剂学；超声造影剂；正交设计；全氟己烷；聚集成像

超声诊断具有安全性高、无创伤性、成本低、病人顺应性好的优点，被广泛应用于多种疾病的治疗[1-3]，包括心血管疾病、妇产科、肿瘤等方面的检查。因某些组织病变前后的超声特性变化不大，因此能增强组织和血液回波能力的超声造影剂受到极大关注，早在1968年Gramiak等就将生理盐水作为超声造影剂得到了主动脉根部的云状回声图像[4]。经过几十年的发展，超声造影剂已经过了以Albunex®为代表的以空气或氧气为主要成分的第一代造影剂到以SonoVue®为代表的以氟碳类惰性气体为主要成分的第二代造影剂。现在临床上应用的是第二代造影剂，这类造影剂也被称为微泡造影剂，粒径在1～10 μm，回波特性好[5]，但因其微米级的粒径，血液清除较快，只有几分钟的成像时间，且无法到达病灶组织深部，也就限制了超声分子显像及药物的靶向输送[6]。因此，近些年以液态氟碳为主要成分的纳米级造影剂成为研究的热点[7-9]。这类纳米级超声造影剂可以利用肿瘤的高通透及滞留(EPR)效应累积到肿瘤内部，满足肿瘤内部分子显像的要求。这种造影剂的成像原理多为聚集成像[10]，Juan Li等制备了一种靶向神经肽YY1受体的液态氟碳造影剂，通过靶向作用在肿瘤部位累积，增强了肿瘤内部的超声信号[11]。本文作者通过正交试验设计优化处方组成，利用超声-薄膜法制备了一种纳米级超声造影剂，对其物理稳定性及体外显像效果进行了考察，同时评价了其在4T1荷瘤小鼠体内经静脉注射后累积到肿瘤部位并实现超声造影增强的可能性。

1 仪器及材料

RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，92-IIDN超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），KQ5200E超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司），AR224CN电子天平（奥豪斯仪器有限公司），Milli-Q超纯水仪(Millipore Co., USA)，ZS90激光粒度仪( Malvern Co., UK)，Freezone冷冻干燥机( Labconco CO., England)，JEM-1230透射电子显微镜(日本电子株式会社, Japan)，IU22超声诊断仪(荷兰飞利浦公司)。

大豆卵磷脂(S100)、蛋黄卵磷脂(E80)、胆固醇(Chol)（德国lipoid公司），全氟己烷(PFH，百灵威科技有限公司)，琼脂粉(国药集团化学试剂有限公司)，DMEM高糖细胞培养基（Dulbecco's Modified Eagle high glucose Medium，Gibco BRL，USA），胰蛋白酶（Trypsin，Gibco BRL，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），其他试剂（分析纯，市售）。

选用鼠源乳腺癌细胞4T1，使用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基(含青霉素、链霉素各100 U∙mL-1)，并置于37 ℃含体积分数5% CO2的培养箱中培养，常规胰酶/EDTA消化传代。

Balb/c雌鼠，体质量（20±2）g，SPF级，上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2012-0002。

2 方法

2.1 纳米级超声造影剂的制备

采用薄膜-超声法制备造影剂，称取处方量的磷脂及胆固醇，并溶解于5 mL氯仿中，完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，得到的磷脂薄膜用2 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)水化后，在冰浴下向其中加入一定量的PFH，并在冰浴下进行探头超声，超声设置为20%振幅，工作1 s，间歇5 s，共超声8 min，得到2 mL的造影剂，并置于4 ℃冰箱中储存。

2.2 正交试验设计

经前期的文献考察及预实验考察发现：磷脂种类、胆固醇的用量及全氟己烷的加入量对造影剂粒径的大小及稳定性影响较大，因此，将以上三种因素作为考察因素，以第0天的粒径大小与72 h内的粒径稳定性（即72 h后测得的粒径与第0天时检测的粒径之差）作为评价指标，以上两个指标的权重分别设置为60%和40%，即，试验结果=第0天的粒径大小×60%+(72 h后粒径大小－第0天粒径大小)×40%。设计L9(34)正交试验表进行研究(表1)。

Table 1 L9(34) Orthogonal table

2.3 粒径检测

按照正交表制备的制剂，用pH=7.4的PBS稀释50倍后检测粒径。应用Malvern激光粒度仪，利用动态光散射法检测制剂0 d及放置3 d时的粒径，以二者的差值为指标，越小说明制剂的物理稳定性越好。筛选出最佳处方后，对其进行验证，透射电子显微镜(TEM)观察粒子形态，并监测其10 d内的粒径变化。

2.4 体外超声显像的研究

以质量分数1%的琼脂糖凝胶作为成像基质，制作孔径约1 cm的凝胶孔洞模型，将自制的造影剂200 μL置于模型中，以pH=7.4的PBS为阴性对照，应用飞利浦IU22超声诊断仪检测二者的超声成像情况，并选择PBS或造影剂所在的区域为兴趣区(region of interest, ROI)，用image J分析ROI区域的灰度，定量比较PBS组与造影剂组超声信号的差异。

2.5 体内超声显像的研究

首先制作4T1荷瘤小鼠模型，待接种的4T1细胞采用胰酶/EDTA消化收集后，用无血清的DMEM培养基稀释，得到的细胞悬液以2×106个/只的数量接种到Balb/c雌性小鼠腹部乳房脂肪垫，得到4T1荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到约300 mm3时，经尾静脉注射自制造影剂200 μL (PFH的体积分数为3%)，注射24 h后，应用超声诊断仪拍摄肿瘤部位的超声图像，以未注射造影剂的荷瘤小鼠作为阴性对照，比较两者的超声信号差异。

3 结果

3.1 正交试验结果

如表2所示，由极差结果可知，对制剂稳定性影响大小的因素排序为﹥﹥，即胆固醇用量﹥全氟己烷体积分数﹥磷脂种类，且最佳处方组合为以E80和S100的质量比为1∶1作为膜材料，全氟己烷的加入量为60 μL。由表3的方差分析可知以上三个因素对制剂稳定性的影响不显著。按照最佳处方制备出的造影剂粒径为（304.0±19.2）nm，多分散指数(PDI)为0.171±0.032；图1所示为10 d内自制造影剂的粒径分布情况，第1天、第3天、第7天、第10天的粒径分别为264.9 nm(PDI: 0.217)、274.4 nm(PDI: 0.157)、317.2 nm(PDI: 0.249)、313.7 nm (PDI: 0.207)，10 d内粒径的变化较小说明制剂的物理稳定性较好。图2为制剂的TEM图，造影剂基本呈圆形，粒径与动态光散射法测出的数据基本一致。

Table 2 Orthogonal test results

Table 3 Variance analysis

─ —The particle size on 1st day; ─ —The particle size on 3rd day; ─ —The particle size on 7th day; ─ —The particle size on 10th day

Fig. 2 The TEM of contrast agent

3.2 体外显像分析

应用飞利浦c5-2低频探头检测凝胶孔洞模型的超声显像情况，显像深度为15 cm。IU22超声诊断仪是辉度调制型超声诊断仪，这种诊断仪把接受到的回声以光点显示，光点的灰度等级代表回声的强弱，回声越强灰度越大。图3a所示为PBS组的超声图像，黄色虚线圈出的区域为PBS所在的部位，符合超声显像中液体的表现特性——液性暗区，这一区域上方的亮白色线状区域为制作凝胶模型时两次凝胶浇筑的界面，因有空气存在导致回声信号很强；图3b所示为自制超声造影剂组的超声图像，黄色虚线圈出的区域为造影剂所在的部位，超声信号较强。用image J对以上两组图像的ROI区域的灰度值进行分析，PBS组ROI区域的灰度值为0.144，而造影剂组为0.352，明显高于PBS组，说明造影剂可以增强超声显像的效果。

a—The in vitro ultrasound image of the group of PBS, the yellow dotted line circled the location of PBS, which was almost not detected ultrasonic signal; b—The in vitro ultrasound image of the group of contrast agent, the yellow dotted line circled the location of contrast agent where the grey scale was higher, indicating the enhanced effect of ultrasound imaging of contrast agent

3.3 体内超声显像分析

因纳米级造影剂的成像原理为聚集成像，所以超声信号增强的前提条件是造影剂在靶部位大量累积。自制的纳米级造影剂经尾静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内，必须经过一定时间的分布，利用实体瘤的EPR效应大量累积到肿瘤内部后才有可能在肿瘤部位超声信号增强的效果。未注射造影剂的荷瘤小鼠肿瘤部位的超声图像如图4a所示，黄色虚线圈出了肿瘤的位置，肿瘤内部回声信号很低；将自制造影剂经尾静脉注射24 h后，检测肿瘤部位的超声成像情况，结果如图4b所示，黄色虚线圈出了肿瘤的位置，可以明显的看到肿瘤内部较强的超声信号，说明自制造影剂在24 h内累积到了肿瘤内部，并增强了肿瘤内部的超声显像效果。

a—The in vivo ultrasound image of tumor sites in 4T1 tumor bearing mice without injection of contrast agents; b—The in vivo ultrasound image of tumor sites in 4T1 tumor bearing mice at 24 h after injection of contrast agents.The yellow dotted line circled the tumor site. The 4T1 tumor bearing mice without injection of contrast agent was almost not detected ultrasonic signal in the tumor, while after intravenous injection of contrast agent 24 h, due to accumulation of contrast agent in the tumor of 4T1 tumor bearing mice, the tumor were detected some ultrasonic signal (yellow arrow pointed)

4 结论

作者制备了一种纳米级包裹液态氟碳的超声造影剂，粒径为(304.0±19.2) nm， PDI为0.171±0.032，10 d内粒径变化很小，稳定性好。体外超声显像试验中造影剂组与PBS组比较灰度值有明显的升高，表明这种超声造影剂可以显著增强超声信号。造影剂经静脉注射后，其300 nm左右的粒径可以保证造影剂能够利用实体瘤的高通透性和滞留效应累积到病灶部位，体内超声显像实验中注射造影剂组，肿瘤内部开始出现较强的超声信号，一方面说明自制造影剂可以通过聚集成像的原理实现超声造影，另一方面也印证了其在肿瘤部位的大量累积，这是药物的靶向运输的前提条件，也为肿瘤的诊疗结合奠定了基础。

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Preparation and characterization of a new nanometer ultrasound contrast agent

HOU Wanqing1,2, GUO Xiaomeng2, LUO Lihua2, FAN Yuling1*, YOU Jian2*

(1150028; 2310058,)

To develop a nanometer ultrasound contrast agent, and evaluateits enhanced effect of ultrasound imageand.The nanometer ultrasound contrast agent was prepared by the thin film ultrasonic method, and the optimum formulation was optimized by orthogonal design. The 1% agarose gel pore model was used to evaluate the enhanced effect of ultrasound image of the nanometer ultrasound contrast agent with phosphate buffer used as a negative control. 4T1 tumor bearing mice were selected forultrasound imaging. After 24 h of intravenous injection, the ultrasound image of the tumor site was obtain.The optimum formulation was that the weight fraction of egg yolk lecithin and soybean lecithin was 1∶1 and the concentration of perfluorohexane was 3%. The particle size of prepared nanometer ultrasound contrast agent was (304.0±19.2) nm with the polydispersity index (PDI) of (0.171±0.032), which was relatively stable after the storage for ten days at 4 °C. Theultrasound imaging showed that the contrast agent can significantly enhance echo signal.ultrasound imaging showed that the contrast agent could accumulate in the tumor sites and enhance the echo signal.The self-made nanometer ultrasound contrast agent is stable, having good performance in ultrasound imaging, which lays the foundation for the ultrasonic diagnosis and therapy of tumor.

pharmaceutics; ultrasound contrast agent; orthogonal design; perfluorohexane; aggregation imaging

(本篇责任编辑：赵桂芝)

（2017）05–0111–08

10.14146/j.cnki.cjp.2017.05.002

R943

A

2017-02-23

侯婉晴(1992-)，女(汉族)，河南郑州人，硕士研究生，E-mailhouwq0916@163.com；

*通讯作者：游剑(1975-)，男(汉族)，湖南株洲人，教授，博士，博士生导师，主要从事药剂学方面的研究，Tel.571-88981651，E-mail youjiandoc@zju.edu.cn。