傅雁辉，聂 丽，夏 凡，舒群峰，魏赛金



松乳菇液态发酵培养基研究

傅雁辉，聂 丽，夏 凡，舒群峰，魏赛金*

（江西农业大学江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西南昌 330045）

选用松柏外生菌根真菌松乳菇（）为对象，研究该菌最适碳源、氮源、无机盐、生长因子及培养基优化。结果表明：松乳菇的最适碳源为蔗糖，菌丝干重为0.49 g；最优氮源为蛋白胨，菌丝干重为0.68 g；MgSO4、维生素B1对菌丝生长的促进作用最为明显，其菌丝干重分别为0.42 g、0.48 g。二次正交旋转设计试验得出该菌最适培养基配方为蔗糖37.42 g/L、蛋白胨3.13 g/L，MgSO40.1 g/L，VB125 mg/L，pH为7。

松乳菇；发酵培养基；优化；菌丝干重

松乳菇（)是一种红菇科、乳菇属的食用菌，又名美味松乳菇、雁来菌、松树蘑，是一种深受大众喜爱的美味野生食用菌[1]。松乳菇营养丰富，肉质细嫩，口味鲜美，具有抗菌抑制肿瘤等多种作用[2]。松乳菇的氨基酸含量远高于香菇，尤其是天冬氨酸和谷氨酸的含量较高，所以松乳菇具有很强烈的鲜味。从松乳菇中提取的多糖具有多种功效，如可以提高人体的免疫力、抑制菌体的生长和抗癌等，其多糖提取物可以抑制肉瘤2180的生长，对艾氏腹水癌同样有抑制作用，其产生的乳菇紫素也具有抗菌的作用[3-4]。研究表明野生松乳菇子实体含有较高的Ga、Fe、Zn等人体所需的矿质元素，但菌丝体中的矿质元素的含量受培养基成分影响而有所差别，所以可以通过改变培养基的成分人为地调控松乳菇菌丝体中矿质元素的含量[5]。松乳菇属于菌根菌，一般与松柏等形成菌根，因其与植物共生，所以有着特殊的营养方式和生活条件需求，因而目前国内没有成功人工驯化栽培松乳菇[6]，市场上的供应完全依赖野生采集，为了合理开发利用和保护这一珍贵的食用菌资源，人工培养松乳菇菌丝体取代子实体进行开发利用是十分有效且便捷的方法[7]。

林亲雄[8]、李静[9]、廖晓初[10]、龙芳[11]等分别探索了碳源、氮源、生长调节物质对松乳菇菌丝生长的影响，以确定适宜松乳菇菌丝生长的最佳培养基组成，但松乳菇菌丝生长的条件因研究实验设计的不同和培养基的不同，最适值亦有所差异。鉴于此，试验从碳源、氮源、无机盐、生长因子等方面对松乳菇摇瓶发酵条件进行研究，寻找松乳菇菌丝生长的最佳培养基配方。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株为松乳菇，由江西宜春职业技术学院惠赠。MgSO4，KH2PO4、GuSO4和无水NaCO3、维生素B1、维生素B2、甘氨酸、麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、柠檬酸二胺等均为国产分析纯；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸提液等均为国产生化试剂。

1.2 仪器与设备

MP1002电子精密天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LRH-250A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；SPY50双层培养摇床：上海市离心器械研究所；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2G双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基配制 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。液体种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，无水MgSO41 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。基础发酵培养基：葡萄糖20 g，NH4Cl 2 g，KH2PO42 g，无水MgSO41 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。以上培养基均需121 ℃灭菌30 min备用。

1.3.2 松乳菇发酵培养 将PDA培养基上活化的松乳菇接种到液体种子培养基中，180 r/min、30 ℃培养24 h即得种子液。按接种量10%将种子液接种到发酵培养基中，180 r/min、30 ℃培养5 d，培养2 d后每24 h取样，每个处理重复3瓶。过滤获得菌丝，80 ℃烘烤至恒重，测得菌丝生长干重来确定不同组分对松乳菇生长的影响。

1.3.3 碳源对松乳菇菌丝生长的影响 供试碳源有麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和糊精。使用相同质量的不同碳源代替基础发酵培养基中的葡萄糖，测定菌丝干重。

1.3.4 氮源对松乳菇菌丝生长的影响 供试氮源有牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、柠檬酸二胺、酵母浸提液和草酸铵。使用相同质量的不用氮源代替基础发酵培养基中的NH4Cl，测定菌丝干重。

1.3.5 无机盐对松乳菇菌丝生长的影响 供试无机盐有MgSO4，KH2PO4、CuSO4和无水NaCO3。用供试无机盐代替基础发酵培养基中的无水MgSO4和KH2PO4，供试水平为1 g/L，以基础发酵培养基为空白对照，测定菌丝干重。

1.3.6 生长因子对松乳菇菌丝生长的影响 供试生长因子有维生素B1、维生素B2、甘氨酸和肌醇。将供试生长因子加入到基础发酵培养基中，甘氨酸、肌醇在每100 mL培养基中加入0.5 mg，VB1、VB2加入2.5 mg，以基础发酵培养基做空白对照，测定菌丝干重。

1.3.7 松乳菇最优碳源、氮源二次正交旋转设计试验 利用DPS统计分析软件设计二次正交旋转设计试验，以蔗糖30 g/L和蛋白胨3 g/L为零点，以10 g/L和1 g/L分别为蔗糖和蛋白胨的正负1区间进行实验，调整pH为7，每个处理做5个平行实验，180 r/min、28 ℃培养5 d，测定菌丝干重。

表1 碳源和氮源的二次正交旋转设计

1.4 数据分析

采用DPS数据处理系统和Originpro9.0画图软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌丝摇瓶发酵生长的影响

由表2可知，松乳菇对供试的8种碳源均能利用，在不同碳源培养基中菌丝干重不同。且随着培养时间的延长，除糊精外，菌丝干重变化明显，麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖培养基在发酵72 h菌丝干重达到最大值。在120 h时，以蔗糖为碳源的发酵培养液中菌丝体干重最大，为0.49 g，因此蔗糖是松乳菇摇瓶发酵的最优碳源；菌丝干重最小的碳源为可溶性淀粉。

表2 不同碳源物质对松乳菇菌丝生长的影响

表中数据为3次重复的平均值±标准误。同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(＜0.05)，下同。

图1 不同氮源物质对松乳菇菌丝生长的影响

2.2 氮源物质对松乳菇菌丝摇瓶发酵生长的影响

由图2可知，松乳菇对9种供试氮源都可以利用，但在不同氮源的培养基上菌丝体干重量差异显著。方差分析表明，同一氮源不同培养时间发酵培养液中，松乳菇菌丝干重存在显著差异。在120 h时，以蛋白胨为氮源的发酵培养基中菌丝干重最大，为0.68 g，因此蛋白胨是松乳菇摇瓶发酵菌丝生长的最优氮源；其次为酵母膏，菌丝干重量为0.67 g；菌丝干重量最小的氮源为草酸铵，为0.08 g。

2.3 无机盐对松乳菇菌丝摇瓶发酵生长的影响

由表3可知，4种供试无机盐对松乳菇菌丝体的生长均有促进作用，加入不同无机盐的发酵培养基中菌丝体干重不同，且随着培养时间的延长，菌丝干重均有变化，其中培养96 h时，在加入MgSO4的发酵培养基中菌丝体干重最大为0.42 g；而且在含MgSO4的发酵培养基中，从初期到发酵终点菌丝生长一直都比较旺盛。因此MgSO4是松乳菇菌丝摇瓶发酵生长最适无机盐。

表3 不同无机盐对松乳菇菌丝生长的影响

2.4 生长因子对松乳菇菌丝摇瓶发酵生长的影响

由图2可知，4种供试维生素对松乳菇菌丝体的生长均有促进作用，但在加入不同维生素的发酵培养基中菌丝干重不同，其中以加入维生素B1的发酵培养基中菌丝体干重最大，为0.48 g；其次为维生素B2，其菌丝干重量为0.47 g。

图2 不同生长因子对松乳菇菌丝体生长的影响

2.5 松乳菇摇瓶发酵最优培养基的确定

不同营养因子中碳源和氮源对松乳菇摇瓶发酵菌丝生长影响较大。以菌丝体生长量为响应值，对试验结果进行二次回归分析，回归方程为：

=－0.261 6+0.012 871+0.099 812－0.000 129 112－0.009 6622－0.001 112。

由相应数据的方差分析结果（表4）可以看出，回归模型的<0.001，说明回归模型显著，模型的拟合程度较好。从图3中可以看出，回归方程存在稳定点（极大值）。通过计算，碳源及氮源的最佳浓度分别为1=37.421，2=3.131，此时菌丝体生长量最大，达到0.128。

表4 旋转中心组合设计方差分析

*** 表示差异极显著（<0.001 0），** 表示差异极显著（<0.01），* 表示差异显著（<0.05）

图3 松乳菇发酵最优培养基响应面图

3 讨论与结论

3.1 讨 论

在松乳菇菌丝培养过程中，使用较多的碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米粉等[12-14]。对于哪种碳源更适于松乳菇生长，分歧较大。研究表明，被认为合适的碳源有葡萄糖[15]、麦芽糖[13-14]、蔗糖[12]、可溶性淀粉[8]等。本试验供试碳源中，最优碳源是蔗糖，其促生效果是可溶性淀粉的3.5倍。与苏菲娅等[16]、林亲雄等[8]得到的最适碳源为可溶性淀粉的结果差异很大。松乳菇能利用的氮源较多，主要有蛋白胨、硝酸钾、乙酸铵、硫酸铵、酒石酸铵、甘氨酸等。试验发现，最适于松乳菇生长的是蛋白胨，结果与林亲雄等[8]、周传云等[17]一致，但与廖晓初等[10]、周国英等[12]研究结果不同。在实验中，以可溶性淀粉和乳糖为碳源培养基培养的菌丝生长量最低，可能与它们的溶解度和利用率有关，在以氨基酸和无机氮源的培养基上，松乳菇菌丝生长较慢，因此松乳菇对有机复合氮源的利用更有优势。至于何种碳源、氮源更合适，应与所用菌株或培养基有关，这有待于进一步研究。4种供试无机盐MgSO4、KH2PO4、CuSO4和无水NaCO3对松乳菇菌丝生长均有促进作用，其中MgSO4的促进作用最大；4种供试生长因子VB1、VB2、肌醇和甘氨酸对松乳菇菌丝生长均有促进作用，其中维生素B1的促进作用最大。

3.2 结 论

摇瓶培养松乳菇的最适碳源为蔗糖，氮源为蛋白胨。MgSO4、维生素B1对菌丝生长的促进作用最为明显。结合二次正交旋转试验，优选的松乳菇摇瓶发酵最优培养基配方是蔗糖37.42 g/L，蛋白胨3.13 g/L，MgSO40.1 g/L，维生素B125 mg/L，pH为7，培养温度为28 ℃，该种摇瓶培养方法为加深松乳菇的研究奠定了基础。

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Study on Liquid Fermentation Medium for the Cultivation of

FU Yan-hui, NIE Li, XIA Fan, SHU Qun-feng, WEI Sai-jin*

(Jiangxi Provincial Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

was selected as potential strain to study the optimum carbon, nitrogen source, inorganic salt, growth factor and optimization of culture conditions.The results showed that the optimal carbon source was sucrose and the dry mycelial weight of source was 0.49 g. The optimal nitrogen source waspeptone and the dry mycelial weight of peptone was 0.68 g. MgSO4and Vitamin B1played a most evident role in promoting the growth of mycelium, and the dry mycelial weight ofthem were 0.42 g and 0.48 g, respectively.In the quadratic orthogonal rotation design, the optimal carbon source and the optimal nitrogen source of the best medium were 37.42 g/L of sucrose, 3.13 g/L of peptone, MgSO40.1 g/L, VB125 mg/L, pH 7.

; fermentation medium; optimization; dry mycelial weight

S435.621

A

2095-3704（2017）03-0199-06

2017-08-30

江西省科技计划项目(20133BBG70090)和江西农业大学大学生创新训练计划项目（201410410042）

傅雁辉，硕士研究生，主要从事微生物应用研究，fyh8818@163.com；

*通信作者：魏赛金，女，教授，博士，主要从事微生物应用研究，weisaijin@126.com。

傅雁辉, 聂丽, 夏凡, 等. 松乳菇液态发酵培养基研究[J]. 生物灾害科学, 2017, 40(3): 199-204.