齐梦蝶　王健　马晓晶　张权　王方方　康莹　刘勇 林慧馨

[摘要]蛋白质复合物参与植物多种次生代谢物的合成，其分离对阐明植物次生代谢及提高体外催化效率至关重要。该研究构建了过表达丹参酮合成途径关键酶CYP76AH1的转基因毛状根株系，通过Western杂交筛选得到高表达CYP76AH1蛋白的丹参转基因毛状根，并以此作为后续提取丹参酮合成途径中蛋白质复合物的组培材料。通过优化蛋白提取缓冲液中的去污剂种类和浓度，筛选出含05% Triton X100的缓冲液为最佳提取缓冲液，并分离得到相对大量的可溶性CYP76AH1蛋白质。该研究为后续进一步分离纯化与CYP76AH1相互作用的蛋白质复合物奠定了基础，也为深度解析丹参酮合成代谢通路提供思路。

[关键词]蛋白质复合物； 次生代谢物； 丹参酮； CYP76AH1； 转基因毛状根； 去污剂

[Abstract]Protein complexes are involved in the synthesis of multiple secondary metabolites in plants， and their separation is essential to elucidate plant secondary metabolism and improve in vitro catalytic efficiency In this study， the transgenic hairy roots of CYP76AH1， a key enzyme of tanshinone synthesis pathway， was constructed and the transgenic hairy roots of Danshen overexpressing CYP76AH1 protein were screened by Western blotting and used as a tissue culture material for the subsequent extraction of protein complex in tanshinone synthesis pathway By optimizing the type and concentration of the detergent in the protein extraction buffer， the buffer containing 05% Triton X100 was selected as the best extraction buffer， and a relatively large amount of soluble CYP76AH1 protein was isolated This study lays the foundation for the further separation and purification of protein complexes interacting with CYP76AH1， and provides the idea for deep analysis of tanshinone metabolic pathway.

[Key words]protein complexes； secondary metabolism； tanshinone； CYP76AH1； transgenic hairy root； detergent

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，是最常用的活血化瘀类中药之一[1]。丹参的主要成分丹参酮[2]是松香烷型二萜化合物，不仅具有抗肿瘤活性[34]，同时具有治疗心脑血管疾病的作用[5]，在临床上应用广泛。丹参在我国分布广泛，但是随着丹参需求量剧增，野生丹参资源已不能满足市场需求，而各地栽培的丹参质量参差不齐，有效成分含量低，这已成为丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的一个最大障碍。利用现代分子生物学技术，研究丹参酮等次生代谢物的生物合成途径，分离参与该途径的蛋白質复合物，阐明相关蛋白之间相互作用，利用合成生物学手段，实现丹参酮异源高效生产将是大量获取丹参酮，缓解供给压力最有潜力的方法之一。……