李鑫辉，黄淼鑫，杜建芳，黄政德,许福丽，肖 青，郭晨鹤，李彩云

（湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208）

丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮的保护作用

李鑫辉，黄淼鑫，杜建芳，黄政德,许福丽，肖 青，郭晨鹤，李彩云

（湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208）

目的通过观察心肌缺血再灌注损伤大鼠NO水平、eNOS蛋白和eNOS mRNA表达，探讨丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮保护作用。方法大鼠60只，随机分为假手术组、模型组、重组人红细胞生成素（recombinant human erthropoietin，rhEPO）动员组、丹参通络解毒汤组；丹参通络解毒汤联合动员组，每组12只。于造模后14d采用放射免疫法测定NO水平、免疫组化法测定eNOS蛋白和采用实时荧光定量PCR法测定eNOS mRNA表达。结果与假手术组比较，各组NO水平，eNOS蛋白和eNOS mRNA表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组NO水平升高，eNOS蛋白和eNOS mRNA表达明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与rhEPO动员组和丹参通络解毒汤组比较，丹参通络解毒汤联合动员组NO水平显著升高，eNOS蛋白和eNOS mRNA表达明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论丹参通络解毒汤可以提高缺血心肌eNOS mRNA表达，进一步促进eNOS蛋白表达，升高NO水平，是该方保护心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮重要机制之一，同时该方联合动员剂对内皮保护有增强促进作用。

eNOS；心肌缺血再灌注损伤；骨髓干细胞；丹参通络解毒汤

缺血性心脏病是一种严重危害人类健康的常见疾病，其最有效的治疗措施是恢复血液供应，但心肌恢复血流再灌时又可以使缺血心肌损伤加重，即心肌缺血再灌注损伤 (ischermic reperfusion injury,IRI)。近年来，干细胞治疗心肌IRI是近年临床和科研的研究热点，有研究证明IRI后人体能动员自身骨髓干细胞，并迁移到缺血部位，在心脏微环境的影响下，分化为心肌细胞、血管内皮细胞等，进而促进心肌组织修复[1]。然而，迁移到缺血部位的干细胞数量极少[2]，不能很好的恢复心脏功能。因此，采用骨髓干细胞动员剂可以很好的提高外周血液中干细胞数量，从而促进心肌组织的修复[3]。有研究表明中药对干细胞的动员、归巢、增殖和分化有优势互补、协同增效的作用[4]。本文探讨丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮保护作用的分子机制，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠60只，体质量200～250g。由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物许可证号SCXK（湘）2009-0001。

1.2 主要试剂及药品

Trizol试剂盒（批号：16495023）；AMV 逆转录酶（批号：16374121）；RNA 酶抑制剂 （批号：163255012）；RNasin，Taq 酶（批号：16443013）；以上皆来源于美国Invitrogen公司。PCR 引物(批号：SH16385401，上海Invitrogen 公司)；rhEPO（批号：JT196236，华北制药集团金坦生物技术公司）；eNOS一抗、即用型SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；羊抗兔 HRP标记二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

丹参通络解毒汤药（丹参15g，玄参15g，当归10g，川芎 10g，红花 10g，檀香 10g，黄连 6g，栀子 15g，生地黄 15g，麦冬 12g，银花 10g，连翘10g，黄芪30g，水蛭6g等），由湖南中医药大学第一附属医院药房提供。浸泡，煎煮，去渣，水煎浓缩至药液浓度2g/mL（含生药），保存备用。

1.3 主要仪器

Motic B5型显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司；FTI2500 型凝胶成像仪，Pharmacia Biotech；UV-1700PharmaSpec型岛津分光光度计，Japan；UNOⅡ型PCR仪，Germany Biometra公司；sequoia512型超声心动图仪，美国siemens公司。

2 实验方法

2.1 造模方法

大鼠用10%水合氯醛以0.3mL/100g比例腹腔麻醉后，记录标准II导联心电图。连接动物呼吸机，开胸暴露心脏，在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉,使之清楚暴露,并以此静脉为标志进行结扎。以心电图QRS波群增高增宽，ST段抬高，心肌颜色发绀,为结扎成功。以ST段下降1/2,缺血部位心肌颜色恢复为血流再灌注成功[5]。

2.2 动物分组

大鼠60只，随机分为假手术组、模型组、rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤联合动员组。假手术组只穿线不结扎冠状动脉,其余4组行IRI造模，开胸结扎冠脉30min,恢复冠脉血流；rhEPO动员组、丹参通络解毒汤联合动员组在腹腔注射 rhEPO（2 000U/kg），每天 1 次，连续 5d（即造模前1天、造模当天、造模后3天）,假手术组、模型组和丹参通络解毒汤组腹腔注射同容量生理盐水。

2.3 给药剂量及方法

给药剂量按人（60kg）与动物体表面积换算，丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组灌胃丹参通络解毒汤药7.8mL/(kg·d)[相当于生药含量15.65g/(kg·d)]5d（即造模前 2d、造模后 3d），每天1次；假手术组、模型组和rhEPO动员组灌胃等量生理盐水5d，每天1次。

2.4 指标检测

2.4.1 血清NO检测 实验结束后，从实验大鼠腹腔主动脉抽取血液样本存放于离心管中，将离心机设置为2 000r/min离心10min，取其上清液，于-80℃冰箱储藏备用。采用放射免疫法测定，具体操作严格按照试剂盒说明步骤检测血清中NO的含量，并记录下来。

2.4.2 心肌细胞eNOS蛋白表达测定 取各组缺血心肌组织经过4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作免疫组化病理切片（4 μm厚切片）。蛋白表达用免疫组化法检测，按试剂盒使用说明书进行切片脱蜡、灭活内源性酶、热修复抗原、加一抗（1∶100）孵育；加羊抗兔 HRP 标记二抗(1∶15 000)孵育、滴加试剂SABC孵育、显色等操作。以细胞浆呈棕褐色为提高eNOS蛋白阳性表达。用图像分析技术对阳性表达区域进行半定量分析，每张切片在显微镜400倍下随机取5个视野，用彩色病理图像分析系统测量平均灰度。

2.4.3 心肌细胞eNOS mRNA测定 采用实时荧光定量PCR法测定eNOS mRNA的含量，以GAPDH为内参，引物见表1。取心肌组织提取RNA，RNA抽提按照试剂盒说明进行，测纯度 OD260/280 在 1.8～2.0之间良好，说明RNA的完整性好，满足实时荧光定量PCR法分析的要求。具体操作严格按照按照试剂盒说明书将反应设为50 μL体系，94℃变性4min，40个循环扩增（94℃ 40s,57℃ 40s,72℃ 45s)。取10 μL PCR产物按组排列电泳1%琼脂糖凝胶100V电泳1h，凝胶放置于凝胶成像检测仪上观察、照相，记录实验结果。以目的条带与GAPDH基因条带的光密度比值作为目的基因mRNA的表达量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。数据计量资料以“±s”表示，计数资料用例数表示，资料比较先对数据进行方差齐性检验，方差齐采用方差分析，方差不齐采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物及扩增情况

3 结果

3.1 丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌IRI鼠血清NO水平的影响

结果显示，与假手术组比较，模型组、rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组NO 水平均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组 NO 水平明显升高 （P＜0.01）；rhEPO动员组与丹参通络解毒汤组比较，NO水平无统计学差异（P＞0.05）；与 rhEPO 动员组、丹参通络解毒汤组比较,丹参通络解毒汤联合动员组NO水平明显升高（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清NO水平的比较 (±s)

注：与假手术组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；与 rhEPO动员组比较：▲▲P＜0.01；与丹参通络解毒汤组比较：＃＃P＜0.01。

3.2 丹参通络解毒汤联合动员骨髓干细胞对心肌IRI鼠心肌细胞eNOS蛋白表达的影响

结果显示，与假手术组比较，模型组、rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组eNOS 蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组eNOS 蛋白和表达明显升高（P＜0.01）；rhEPO动员组与丹参通络解毒汤组比较，eNOS蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与 rhEPO 动员组、丹参通络解毒汤组比较,丹参通络解毒汤联合动员组 eNOS 蛋白表达明显升高(P＜0.01)，详见表3,图1。

3.3 丹参通络解毒汤联合动员骨髓干细胞对IRI鼠心肌细胞eNOSmRNA表达的影响

结果显示，与假手术组比较，模型组、rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组 eNOSmRNA 表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组eNOSmRNA表达明显升高（P＜0.01）；rhEPO 动员组与丹参通络解毒汤组比较，e NOSmRNA 表达 差 异 无 统 计 学 意 义 （P＞0.05）；与rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组比较,丹参通络解毒汤联合动员组eNOSmRNA表达明显升高 （P＜0.01）。见表3，图2-3。

表3 对心肌IRI鼠心肌细胞eNOS蛋白和eNOSmRNA表达的影响 (±s)

表3 对心肌IRI鼠心肌细胞eNOS蛋白和eNOSmRNA表达的影响 (±s)

注：与假手术组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；与 rhEPO动员组比较： ▲▲P＜0.01；与丹参通络解毒汤组比较：＃＃ P＜0.01。

组别假手术组模型组rhEPO动员组丹参通络解毒汤组丹参通络解毒汤联合动员组n 12 12 12 12 12eNOS蛋白表达131.9±12.69 95.59±11.08△△120.8±9.60△△**115.7±7.54△△**122.1±6.72△△**▲▲＃＃eNOSmRNA 1.285±0.053 0.689±0.017△△0.801±0.018△△**0.781±0.027△△**0.972±0.141△△**▲▲＃＃F P 12.34 0.000 731.6 0.000

图1 eNOS蛋白表达光镜图（免疫组化，×400）

图2 eNOS基因PCR扩增结果电泳图

图3 GAPDH基因PCR扩增结果电泳图

4 讨论

骨髓释放其干细胞到外周血的现象称为骨髓干细胞动员。骨髓干细胞可以分化为多种组织细胞，当心肌细胞损伤坏死引起一系列信号分子的释放，骨髓干细胞可被“征募”到循环中参与远处多种组织的修复和再生，但这种内源性动员作用较弱，可以应用动员剂将更多的骨髓干细胞“驱赶”入血，使外周血干细胞数量增加，并“归巢”于损伤的心肌组织，在特定地组织微环境作用下“分化”为心肌细胞，缩小心肌梗死面积，抑制心室重构的发展，保护内皮细胞，从而改善心脏功能[6]。Rota等[7]人研究表明发生梗死的心脏进行骨髓干细胞移植后，移植的干细胞不仅分化出肌细胞，而且局部移植的骨髓干细胞能够产生包括有心肌细胞和冠脉血管的新生心肌。骨髓干细胞中包含有内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，缺血性损伤及干细胞动员剂能动员EPCs到外周血液中，并归巢到缺血组织，分化成内皮细胞，形成新血管。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)具有抗凋亡、抗炎，促进微血管生成等作用[8]。有研究表明EPO可以诱导血管生成和抑制细胞凋亡[9]，并在动物模型体内显著增强血管内皮祖细胞的动员作用，进而定向分化为成熟的内皮细胞，参与血管新生。在冠心病的发病中起主要作用的是内皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，它主要分布于内皮细胞和心肌细胞中，而干细胞通过旁分泌作用产生有益的细胞因子VEGF通过产生钙离子流的聚集作用下的NOS磷酸化来激活eNOS，eNOS通过催化L-精氨酸生成NO[10]，保护内皮细胞，促进血管新生。本实验研究结果显示，与模型组比较,分别注射干细胞动员剂 rhEPO和给予丹参通络解毒汤中药治疗后，大鼠心肌细胞eNOS mRNA表达和eNOS蛋白表达升高，NO水平升高，两者比较无统计学差异，说明动员剂 rhEPO和丹参通络解毒汤均可以保护内皮，且保护效果相当。同时，动员出来的骨髓干细胞又可以与宿主相互作用而分泌一些细胞因子或神经递质来促进心功能的恢复。骨髓干细胞能够不断分泌脑衍化神经营养因子、神经生长因子以及转化生长因子等对缺血后的组织起到保护作用。本实验研究结果我们还发现丹参通络解毒汤联合动员剂rhEPO使用时，保护内皮效果更强，两者具有相互增强促进作用。因此，我们推测丹参通络解毒汤提高缺血心肌eNOS mRNA表达，进一步促进eNOS蛋白表达，升高NO水平，是该方保护血管内皮重要机制之一，而该方与动员剂相互增强促进作用可能是该方通过改善EPCs迁移、增殖、分化的微环境，增加EPCs的动员量和归巢量，通过细胞的旁分泌作用，促使EPCs分泌一些有益细胞因子，进而保护内皮。

中医学认为，心肌IRI是冠心病的一个病理过程，属于“胸痹心痛”“真心痛”等范畴，其病位在心，涉及血脉，外邪和内邪在机体中积聚日久逐渐蕴积成毒，毒损心络，导致心络不通,即使心肌再灌注治疗血液再通，但缺血心肌组织原有代谢毒物未能排出，对心体的损害进一步加重，如此恶性循环。丹参通络解毒汤是《温病条辨》清营汤和《时方歌括》丹参饮基础上，结合叶天士络病理论及临床实践化裁而来，方中丹参活血化瘀、清心止痛，玄参清营养阴泻火解毒，二者共为君药；臣药有当归、川芎、红花、檀香行气活血，通络止痛。黄连、栀子、生地黄、麦冬养阴清营，泻火解毒；佐使药有银花、连翘增强清热解毒。又由于冠心病病程反复发作，邪据日久，耗气伤正，方中加黄芪益气扶正，以增加益气活血功效。加水蛭增强活血通络作用，藉其“蠕动之物可以松透病根”而直入络分搜剔血络。全方具有活血通络，清营解毒，兼益气养阴的功效，临床治疗冠心病疗效显著。鞠建庆等[11]根据相关统计分析，清热解毒方药治疗不稳定性心绞痛安全可靠，其“热毒伤络”的病机假说具有科学性。郭刚[12]认为“虚—瘀—毒”是冠心病发病基础，而采用活血化瘀解毒中药复方治疗冠心病不稳定性心绞痛的临床效果显著。

综上所述，本研究表明丹参通络解毒汤与动员骨髓干细胞相结合治疗心肌IRI具有协同增效、优势互补作用，为中医药促进骨髓干细胞动员，防治冠心病研究提供实验依据和理论基础。

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Protective Effect of Danshen Tongluo Jiedu Decoction Combined with Bone Marrow Stem Cells Mobilization on the Vascular Endothelial Cells in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

LI Xinhui，HUANG Miaoxin，DU Jianfang，HUANG Zhengde，XU Fuli，XIAO Qing，GUO Chenhe,LI Caiyun
(Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Danshen Tongluo Jiedu decoction combined with bone marrow stem cells mobilization on vascular endothelial cells through observing the changes of NO level,eNOS protein and mRNA eNOS expression in rats with myocardial ischemia reperfusion injuryMethodsThe 60rats were randomly divided into sham-operation group,model group,rhEPO mobilization group,Danshen Tongluo Jiedu decoction (DTJD)group,and DanShen TongLuo JieDu decoction combined with rhEPO mobilization(DTJr)group,12rats in each group.After 14days of modeling,the NO level was determiened by radioimmunaossay.The expression of eNOS protein was assessed by immunocytochemistry method,and eNOS mRNA was measured by real-time fluorescence quantitative PCR method.ResultsCompared with sham-operation group,the levels of NO,eNOS and eNOS reduced significantly(P＜0.01).Compared with the IRI group,the levels of NO,eNOS protein and mRNA eNOS expression in rhEPO mobilization group,DTJD group and DTJDr group increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.01).Cmpared with rhEPO mobilization group and DTGD group,the level of NO,eNOS protein and mRNA eNOS expression in DTJr group increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.01)ConclusionDTJD could improve the expression of eNOS mRNA in endothelial cells and further promote expression of eNOS protein.It is may be one of the mechanisms of protecting endothelial cells in rats with myocardial ischemia reperfusion injury.DTJD combined with mobilization agent could enhance the protective effect on endothelial cells.

endothelial cells;myocardial ischemia reperfusion injury;bone marrow stem cells;DanShen TongLuo JieDu decoction

本文引用：李鑫辉，黄淼鑫，杜建芳，黄政德，许福丽，肖 青，郭晨鹤，李彩云.丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮的保护作用[J].湖南中医药大学学报，2017，37（10）：1070-1073.

R285.5；R541.4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.010.005

2016-12-21

国家自然科学基金面上项目(30973750)；湖南省教育厅科学研究研重点项目（15A143）;湖南省中医药科研计划项目（201559）;湖南中医药大学研究生创新课题(2016cx21)。

李鑫辉，男，博士，副教授，主要从事心血管疾病研究，E-mail:3077314414@qq.com。

（本文编辑 杨 瑛）